張曜 / 必維申美商品檢測(cè)（上海）有限公司

0 引言

食品是人類賴以生存和發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，食源性致病菌危害是食品安全的重要因素[1]，副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是沿海地區(qū)典型的食源性致病菌。廣泛存在于海水、海底沉積物以及魚貝蝦蟹等海產(chǎn)品中，其特點(diǎn)是必須在含鹽量高的培養(yǎng)基上（2%～5%）生長(zhǎng)良好。由該菌引起的食物中毒案例在世界各地均有報(bào)道，受害最嚴(yán)重的國(guó)家和地區(qū)主要包括日本、韓國(guó)、中國(guó)大陸及香港地區(qū)和臺(tái)灣地區(qū)[2-3]，副溶血性弧菌的危害防治是食品安全管理的一個(gè)重要內(nèi)容。

為了防止因食用帶有副溶血性弧菌的海產(chǎn)品而引起食源性疾病，對(duì)其進(jìn)行殺菌是整個(gè)生產(chǎn)流通過程中重要的環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的熱殺菌中，低溫加熱不能將食品中的微生物全部殺滅（特別是耐熱的芽孢桿菌），而高溫加熱又會(huì)不同程度地破壞食品的營(yíng)養(yǎng)成分和天然特性。因此，為了更大限度地保持食品天然的色、香、味和一些生理活性成分，國(guó)際上對(duì)一些新型非熱殺菌技術(shù)的研究已進(jìn)入高潮，如遠(yuǎn)紅外照射技術(shù)，振動(dòng)磁場(chǎng)技術(shù)，高壓脈沖電場(chǎng)技術(shù)等，超聲場(chǎng)因其獨(dú)特的性質(zhì)及規(guī)律，在殺菌研究中引起人們的廣泛關(guān)注，成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究開發(fā)的熱點(diǎn)[6]。

超聲波能夠在極短的時(shí)間內(nèi)殺滅和破壞微生物，還能夠?qū)κ称樊a(chǎn)生諸如均質(zhì)、催陳、裂解大分子物質(zhì)等多種作用，從而能更好地提高和完善食品品質(zhì)，保持食品原有滋味和風(fēng)味[7]，因此超聲波殺菌技術(shù)日益受到關(guān)注[8]。

本文研究超聲波對(duì)副溶血性弧菌的殺滅作用，試驗(yàn)以超聲時(shí)間和頻率因素的變化對(duì)副溶血型弧菌的致死率產(chǎn)生了不同的影響，并初步探討了超聲波以及與溫度協(xié)同作用對(duì)副溶血性弧菌的滅殺作用。同時(shí)通過對(duì)大腸埃希氏菌及金黃色葡萄球菌的滅殺效果來驗(yàn)證該協(xié)同作用的顯著性。

1 材料及方法

1.1 試劑與設(shè)備

1.1.1 試劑

實(shí)驗(yàn)所用的副溶血性弧菌為副溶血性弧菌VP BJ1.1997。該菌株可產(chǎn)生TRH毒素。

實(shí)驗(yàn)室所用的大腸埃希氏菌菌種編號(hào)為ATCC8739。

實(shí)驗(yàn)室所用的金黃色葡萄球菌菌種編號(hào)為ATCC6538。

ATCC：美國(guó)菌種保藏協(xié)會(huì)。

培養(yǎng)基與試劑見表1。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

儀器：超凈工作臺(tái)、生物安全柜、JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎儀、菌落計(jì)數(shù)器、烘箱、培養(yǎng)箱、滅菌培養(yǎng)皿、酒精燈、試管、移液槍等。

表1 培養(yǎng)基與試劑

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法

1）實(shí)驗(yàn)分空白組和試驗(yàn)組，對(duì)超聲波殺菌時(shí)間、功率因素分別進(jìn)行試驗(yàn)。并以水?。?0 ℃）、超聲波+40 ℃、超聲波+50 ℃殺菌效果為對(duì)照,研究超聲波和溫度協(xié)同作用的殺菌效果。

2）將標(biāo)準(zhǔn)菌株按照每個(gè)單因素所要控制的參數(shù)進(jìn)行接種并稀釋到規(guī)定菌液濃度后，盛放菌液的容器為塑料離心管，在無菌條件下將試驗(yàn)管在超聲波中按照不同的頻率、時(shí)間進(jìn)行處理，取樣檢測(cè)。

3）以無菌操作將菌液稀釋至適宜濃度后，選取4數(shù)量級(jí)，每個(gè)數(shù)量級(jí)選取三個(gè)樣本進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。在混勻菌液與培養(yǎng)基過程中注意要使菌液分散均勻且不能有殘留在培養(yǎng)皿邊或蓋上。

4）待相關(guān)培養(yǎng)基中瓊脂凝固后，于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

5）經(jīng)菌落計(jì)數(shù)后，算出每毫升菌液中菌落總數(shù)，最終以算術(shù)平均值求出結(jié)果。

6）試驗(yàn)過程中要重復(fù)實(shí)驗(yàn)兩次以上。

1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

試驗(yàn)組結(jié)果與空白組結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，用Excel計(jì)算滅菌率。

計(jì)算公式：

式中：N—— 樣品中菌落數(shù)；

∑C—— 平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）

菌落數(shù)之和；

n1—— 第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；

n2—— 第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；

d—— 稀釋因子（第一稀釋度）

滅菌率計(jì)算方法：

1.3 試驗(yàn)原理介紹

1.3.1 超聲波殺菌機(jī)理

超聲波是頻率大于20 kHz的聲波，是在媒質(zhì)中傳播的一種機(jī)械振動(dòng)。由于其頻率高、波長(zhǎng)短，除了具有方向性好、功率大、穿透力強(qiáng)等特點(diǎn)，超聲波還能引起空化作用和一系列的特殊效應(yīng)，如力學(xué)效應(yīng)、熱學(xué)效應(yīng)、化學(xué)效應(yīng)和生物效應(yīng)等。

一般認(rèn)為，超聲波所具有的殺菌效力主要由于超聲波所產(chǎn)生的空化作用，使微生物細(xì)胞內(nèi)容物受到強(qiáng)烈的震蕩，從而達(dá)到對(duì)微生物的破壞作用。所謂的空化作用是當(dāng)超聲波作用在介質(zhì)中，其強(qiáng)度超過某一空氣閥值時(shí)，會(huì)產(chǎn)生空化現(xiàn)象，即液體中微小的空氣泡核在超聲波作用下被激活，表現(xiàn)為泡核的振蕩、生長(zhǎng)、收縮及崩潰等一系列動(dòng)力學(xué)過程?？諝馀菰诮^熱收縮及崩潰的瞬間，泡內(nèi)呈現(xiàn)5 000 ℃以上的高溫及109 K/s的溫度變化率，產(chǎn)生高達(dá)108 N/m2的強(qiáng)大沖擊波[4]。利用超聲波空化效應(yīng)在液體中產(chǎn)生的局部瞬間高溫及溫度交變變化、局部瞬間高壓和壓力變化，使液體中某些細(xì)菌致死，病毒失活，甚至使體積較小的一些微生物的細(xì)胞壁破壞，從而延長(zhǎng)保鮮期[5]。

1.3.2 影響超聲波殺菌的因素

超聲波的生物學(xué)效應(yīng)與空化作用有關(guān)，而空化作用又受到超聲波的頻率、照射時(shí)間、菌液濃度及菌液容量等因素的影響。

1.3.3 超聲波的頻率及照射時(shí)間

低頻率的超聲波殺菌效果較差，在較高頻率范圍內(nèi)，超聲波能量大，殺菌效果好。但超聲波頻率太高，不易產(chǎn)生空化作用，殺菌效果反而有所降低。相關(guān)文獻(xiàn)研究了不同功率對(duì)殺菌效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度高功率對(duì)細(xì)菌集團(tuán)的分散效果較好，而高強(qiáng)度低功率對(duì)細(xì)菌的殺滅作用較強(qiáng)。

超聲殺菌效果與其照射時(shí)間成正比，照射時(shí)間越長(zhǎng)，效果越好。研究表明，綠膿桿菌、枯草桿菌的殺滅率和超聲波作用時(shí)間顯著相關(guān)。在較低強(qiáng)度的超聲照射下，以綠膿桿菌殺滅率隨時(shí)間提高最快。下文介紹有關(guān)照射時(shí)間對(duì)副溶血性弧菌的滅殺率的試驗(yàn)。

1.3.4 菌液濃度及菌液容量

在超聲場(chǎng)的作用條件一定時(shí)，菌液濃度高比濃度低時(shí)殺菌效果差，但差別不是很大。以大腸桿菌為例，筆者曾研究超聲波照射時(shí)間與菌液濃度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)對(duì)50 mL濃度為4×105CFU/mL的菌液滅菌需用超聲波照射 20 min，若濃度為 2×107CFU/mL，則需照射40 min。當(dāng)菌液體積減為25 mL時(shí)，則殺滅濃度為4.5×105CFU/mL 的大腸桿菌只需超聲照射 10 min。

超聲波屬機(jī)械波，在媒介傳播的過程中存在著衰減的現(xiàn)象，會(huì)隨著傳播距離的增大而逐漸減弱，因此隨著被處理的菌懸液容量的增大，細(xì)菌受損的百分?jǐn)?shù)將降低。此外，當(dāng)被處理菌懸液中出現(xiàn)駐波時(shí)，細(xì)菌常常聚集在波節(jié)處，在該處的細(xì)菌承受的機(jī)械張力不大，破碎率也最低。因此最好是處理液中不出現(xiàn)駐波，即使處理菌懸液的深度最好短于超聲波在該介質(zhì)中波長(zhǎng)的一半。這也就對(duì)裝樣容器的長(zhǎng)度提出了要求，從理論上說，容器長(zhǎng)度相當(dāng)于1/2波長(zhǎng)的倍數(shù)時(shí)為最好。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲波殺菌時(shí)間因素試驗(yàn)

固定功率 400 Hz，菌液濃度為 106CFU/mL，菌液容量20 mL，超聲波處理后結(jié)果見表2。

表2 超聲波殺菌時(shí)間因素與溫度協(xié)同作用測(cè)定結(jié)果比較表

從表1（B）可以看出，隨著超聲波滅菌時(shí)間的增加，致死率逐漸升高，當(dāng)超聲波滅菌累計(jì)時(shí)間達(dá)到50 min左右時(shí)，被測(cè)菌液中副溶血性弧菌的致死率接近100%。但40 min和50 min的滅菌率差別不是很大，考慮到節(jié)約能源，選擇40 min即可。

根據(jù)Charles R.Stumbo的理論，微生物菌體細(xì)胞喪失繁殖能力便被看作微生物的死亡，而死亡細(xì)胞則被看成已遭到破壞[9]。為了比較直觀明確超聲波滅菌時(shí)間與副溶血性弧菌死亡的關(guān)系，引用表2中的相關(guān)數(shù)據(jù)作了圖1。從圖1可以看出，隨著超聲波滅菌時(shí)間的增加，副溶血性弧菌的致死率成正比例上升趨勢(shì)。當(dāng)累計(jì)殺菌時(shí)間在10～30 min時(shí)，曲線較為陡峭，副溶血性弧菌致死率在39.59%～86.84%之間。當(dāng)累計(jì)時(shí)間達(dá)到30～50 min時(shí)，曲線趨于平衡，說明在超聲波對(duì)副溶血性弧菌的滅殺作用中不隨殺菌時(shí)間的增加而顯著增大。

對(duì)表2（A）（B）兩表進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)超聲波對(duì)于副溶血性弧菌的滅殺作用比較顯著，對(duì)于表2（B）（C）兩表進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)超聲波與溫度協(xié)同作用效果不顯著。

2.2 超聲波殺菌頻率因素試驗(yàn)

在以往許多研究中發(fā)現(xiàn)超聲波頻率的大小對(duì)殺菌效果的影響是很大的。表3中是超聲波頻率因素的測(cè)定結(jié)果。

固定殺菌時(shí)間 15 min；菌液濃度 106CFU/mL；菌液容量 20 mL。

從表3（B）可以看出，隨著超聲波頻率的增高，副溶血性弧菌的致死率隨之升高，頻率在200～500 Hz時(shí)，副溶血性弧菌致死率呈正比例上升趨勢(shì)，曲線也較為陡峭，致死率達(dá)到20.29%～85.48%。但是當(dāng)頻率在500～600 Hz時(shí)，曲線不那么陡峭，致死率上升較慢。但可以預(yù)測(cè)到，當(dāng)頻率達(dá)到600 Hz以上的某一頻率時(shí)，副溶血性弧菌致死率將接近一個(gè)飽和值。

表3 超聲波殺菌頻率因素與溫度協(xié)同作用測(cè)定結(jié)果比較表

（B）殺菌條件：超聲波+40 ℃頻率/Hz 殺菌前濃度/CFU·mL-1殺菌后濃度/CFU·mL-1 致死率200 6.90×106 5.50×106 20.29%300 5.70×106 3.10×106 45.61%400 3.20×106 1.18×106 63.12%500 6.20×106 9.00×105 85.48%600 2.00×106 2.00×105 90.00%（C）殺菌條件：超聲波+50 ℃頻率/Hz 殺菌前濃度/CFU·mL-1殺菌后濃度/CFU·mL-1 致死率200 6.90×106 5.13×106 25.65%300 5.70×106 2.71×106 52.46%400 3.20×106 0.76×106 76.25%500 6.20×106 0.23×106 96.29%600 2.00×106 0.06×106 97.00%

對(duì)表3（B）（C）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)超聲波和溫度協(xié)同作用效果較顯著。

2.3 超聲波與溫度協(xié)同作用對(duì)其他致病菌殺菌效果的影響

50 ℃水浴處理對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有殺菌效果，菌體死亡率隨時(shí)間延長(zhǎng)而上升。大腸桿菌在20 min水浴處理后，死亡率為79.3%。而金黃色葡萄球菌對(duì)溫度更敏感，水浴處理20 min后，死亡率高達(dá)97.1%。超聲波（600 Hz）與50 ℃處理協(xié)同作用，即在50 ℃下進(jìn)行超聲波處理，處理時(shí)間相同時(shí)，兩種致病菌的死亡率均顯著高于50 ℃水浴處理的對(duì)照組。50 ℃進(jìn)行超聲波處理20 min后，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的致死率分別高達(dá)99.3%和99.7%。同時(shí)，超聲波協(xié)同處理殺菌結(jié)果表明，溫度越高，協(xié)同殺菌效果越好（見表4）。

2.4 超聲波與溫度協(xié)同作用的應(yīng)用

試驗(yàn)人員選取了某星級(jí)酒店的中央廚房作為該方法的驗(yàn)證方。從中央廚房分別選取微生物易污染的幾個(gè)作業(yè)區(qū)域：A-刀具、B-托盤為測(cè)試對(duì)象，測(cè)試項(xiàng)目有菌落總數(shù)和大腸菌群，測(cè)試方案及結(jié)果見表5-6。

測(cè)試方法及取樣方法見GB 14934-2016《消毒餐（飲）具》。

2.4.1 2017年11月對(duì)采取常規(guī)消毒方式的作業(yè)區(qū)域進(jìn)行涂抹試驗(yàn)，匯總有陽性檢出的數(shù)據(jù)如表5所示。

2.4.2 2017年12月對(duì)采取超聲和溫度協(xié)同作用消毒方式的作業(yè)區(qū)域進(jìn)行涂抹試驗(yàn)，選擇5 d的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，如表6所示。

通過以上數(shù)據(jù)對(duì)比，超聲和溫度協(xié)同作用的消毒方式效果顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的清潔消毒方式。

表4 溫度與超聲波協(xié)同作用殺菌效果

表5 常規(guī)消毒方式的陽性檢出結(jié)果匯總

表6 超聲（600 Hz）和溫度（50 ℃）協(xié)同作用消毒20 min結(jié)果匯總

3 結(jié)語

綜合以上超聲波對(duì)副溶血性弧菌的殺滅作用的兩個(gè)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，可以概括：一、當(dāng)超聲波頻率、菌液濃度及菌液含量固定時(shí)，隨著超聲波滅菌累計(jì)時(shí)間的增多，對(duì)副溶血性弧菌的滅殺效果越好，但到達(dá)一定時(shí)間后，效果達(dá)到一定值，基本不會(huì)有所提高。二、當(dāng)超聲波時(shí)間、菌液濃度及菌液含量固定時(shí)，隨著超聲波頻率的增高，對(duì)副溶血性弧菌滅殺效果越好；當(dāng)超聲波頻率為400 Hz的時(shí)候與溫度的協(xié)同作用效果不是很顯著。超聲波頻率變化時(shí)與溫度的協(xié)同作用效果顯著[10]，當(dāng)超聲波頻率為500～600 Hz時(shí)與溫度的協(xié)同效果最佳，殺菌率可達(dá)97%左右。

總體而言，用超聲波與溫度的協(xié)同作用的殺菌方式來滅殺食品中副溶血性弧菌效果顯著。因?yàn)槌暡ㄒ云溲杆俸?jiǎn)便、對(duì)人體無害的方式有效地減少副溶血性弧菌的含量，以此減少了毒素產(chǎn)生，特別是TRH毒素。在實(shí)際生活中，很大一部分的副溶血性弧菌的中毒來自于餐具等廚房用具的交叉污染，如果處理加工食物的工具(如操作臺(tái)、刀墩、容器、貯藏室等)生熟不分，生食品中的副溶血性弧菌可通過上述工具污染其他食物，特別是熟食制品。受到副溶血性弧菌污染的食物，在較高溫度下存放，食用前不加熱，或加熱不徹底，會(huì)導(dǎo)致食物中毒。因此，可以用超聲波與溫度協(xié)同作用清洗設(shè)備對(duì)這些餐具進(jìn)行消毒，從而減少人們食入過量副溶血性弧菌產(chǎn)生的毒素而引起中毒。