王光玉,韓亞萌,馮亞麗,陳 雷

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 威海 264209)

隨著海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，在高投入、高產(chǎn)出的模式下，養(yǎng)殖密度超過了水體容量，大量的殘餌、生物代謝產(chǎn)物沉積于池底，池底成為水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中最容易出現(xiàn)問題的部位。底泥是營養(yǎng)物質(zhì)的重要蓄積庫，成為水體營養(yǎng)物質(zhì)的內(nèi)負(fù)荷[1]，沉積在池底的營養(yǎng)物質(zhì)會(huì)持續(xù)釋放到上層水體中，導(dǎo)致藻類繁殖，水體水質(zhì)惡化[2]。對(duì)于生活在水體中下部或底棲生物如刺參、蝦、鮑魚，底質(zhì)環(huán)境條件更為嚴(yán)峻，在某些極端環(huán)境條件下，底質(zhì)惡化導(dǎo)致養(yǎng)殖效益下滑的現(xiàn)狀越來越普遍和顯著。

光合細(xì)菌(Photosynthetic Bacteria，PSB)具有多種代謝方式，根據(jù)光的可用性以及氧氣和合適的碳源等條件，以光能自養(yǎng)或異養(yǎng)方式生長(zhǎng)，在黑暗條件下可以消耗有機(jī)物質(zhì)，有些也可以利用硫化氫[3-4]，能夠利用水中過剩的有機(jī)物質(zhì)作為自身生長(zhǎng)繁殖的營養(yǎng)源，迅速分解水中的氨態(tài)氮、硫化物等有害物質(zhì)，有效降低養(yǎng)殖水體中的化學(xué)耗氧量(COD)、生化耗氧量(BOD)等污染指標(biāo)，提高水體的pH，不消耗額外的氧氣。對(duì)減少底棲生物的環(huán)境脅迫具有重要的改善作用，可以避免極端環(huán)境下的養(yǎng)殖災(zāi)害。

通過富集、分離海洋光合細(xì)菌，篩選優(yōu)勢(shì)菌株，并研究高溫下對(duì)養(yǎng)殖底泥中氨氮、亞硝酸鹽、硫化物、COD的降解能力，以期在水產(chǎn)養(yǎng)殖底質(zhì)改良中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 材料

富集培養(yǎng)基：KH2PO4，1.0 g；NaHCO3，3.0 g；乙酸鈉，2.0 g；NH4Cl，1.0 g；微量元素溶液，1.0 mL；酵母膏，0.5 g；蛋白胨，0.5 g；陳海水，1.0 L，pH 7～8，120 ℃滅菌20 min；NaHCO3，溶液過濾除菌后加入滅菌的培養(yǎng)基中。

分離培養(yǎng)基：NH4Cl，1.0 g；MgCl2，0.2 g；酵母膏，2.0 g；K2HPO4，1.0 g；乙酸鈉，2.0 g；瓊脂，20 g；NaHCO3，2 g；酒，2 mL；海水，1 000 mL，pH 7.0～8.0，120 ℃滅菌20 min；NaHCO3溶液，酒精過濾除菌后加入滅菌的培養(yǎng)基。

儀器和試劑：超凈工作臺(tái)、光照培養(yǎng)箱、梯度PCR儀、電泳儀和電泳槽凝膠成像系統(tǒng)、分光光度計(jì)、細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 海洋光合細(xì)菌的富集、純化

取2 g山東威海海域金海灘排污口附近污泥加入20 mL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入高壓滅菌的富集培養(yǎng)基，在光照、微好氧條件下，28 ℃進(jìn)行富集培養(yǎng)，7 d后棄去培養(yǎng)基，添加新的富集培養(yǎng)基，連續(xù)富集3周。采用雙層平板法對(duì)附著在瓶壁苔和液體的菌液進(jìn)行分離，將平板置于2 000 Lx、28 ℃條件下培養(yǎng)10～12 d，待平板長(zhǎng)出紅色菌落后挑取單菌落，連續(xù)多次平板劃線，分離出純種，觀察光合細(xì)菌的形態(tài)。

1.2.2 16S rDNA序列測(cè)定

挑取單菌落接入裝有液體培養(yǎng)基的試管中，隔絕空氣，2 000 Lx、28 ℃條件下靜置培養(yǎng)。待菌體生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期，利用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒，提取其基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測(cè)定序列，測(cè)序結(jié)果提交到NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比對(duì)。采用MEGA5.0的鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，并與Bootstrap對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行1 000次可信度分析。

1.2.3 光合細(xì)菌對(duì)底泥的改良試驗(yàn)

(1)

式中：w為降解速率；c0和c分別為初始和取樣時(shí)各指標(biāo)質(zhì)量濃度，mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 光合細(xì)菌的富集

污泥來源的光合細(xì)菌富集過程中，富集液中菌體生長(zhǎng)情況如圖1所示。從圖中可以看出，富集1周后，培養(yǎng)瓶中富集液開始呈現(xiàn)出紅色；富集2周后菌液呈現(xiàn)加深，瓶壁有菌體附著，有紅色的菌落沉積在培養(yǎng)瓶底部；富集3周后，富集液中菌體顏色再次加深，變?yōu)榧t棕色，培養(yǎng)瓶底部紅色沉淀增多，瓶壁有時(shí)綠色菌體附著。

圖1 光合細(xì)菌富集過程菌體生長(zhǎng)情況

富集培養(yǎng)基中含有大量的有機(jī)物，進(jìn)行密閉光照培養(yǎng)可滿足光合細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝，尤其可以滿足以紅螺菌為目標(biāo)培養(yǎng)物的菌株。培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)光合細(xì)菌的貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象極為明顯，極易吸附在其他物體的表面，從顏色、細(xì)菌質(zhì)量濃度和處理表觀，光合細(xì)菌富集效果明顯。

VOCs的凈化處理工藝可以分為回收和破壞兩大類，其中：回收凈化工藝主要包括吸收法、吸附法、膜分離法、冷凝法等，一般是通過物理方法，如改變溫度、壓力或采用選擇性吸附劑和選擇性滲透膜等，來富集分離VOCs；破壞工藝則主要包括燃燒法、生物分離法以及等離子氣體法等，主要通過化學(xué)或生化反應(yīng)，用熱、微生物和催化劑等將VOCs轉(zhuǎn)變成為CO2和H2O等無毒害的無機(jī)小分子化合物。

2.2 光合細(xì)菌的分離純化

取富集的光合細(xì)菌富集液稀釋涂布后觀察平板上菌落的形態(tài)，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，觀察顯微鏡下菌體形態(tài)。試驗(yàn)共獲得5株光合細(xì)菌，菌落的形態(tài)及菌體的形態(tài)見表1。

表1 5株光合細(xì)菌的形態(tài)

2.3 菌株16S rDNA序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

5株光合細(xì)菌的16S rDNA片段經(jīng)PCR擴(kuò)增后片段大小約為1500 bp，PCR產(chǎn)物為目標(biāo)條帶。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，將獲得的菌株的16S rDNA序列，運(yùn)用Blast序列比對(duì)程序，與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)測(cè)得的16S rDNA序列，采用MEGA5.0的鄰接法(NJ)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，并用Bootstrap對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行1 000次可信度分析(圖2和圖3)。

如圖2所示，PSB1與RhodopseudomonaspalustrisPSB07-19在同一分支上，序列比對(duì)結(jié)果顯示與其相似性達(dá)到100%；PSB4與RhodopseudomonaspalustrisstrainATCC 17001在同一分支上，序列比對(duì)結(jié)果顯示與其相似性達(dá)到100%，因此將菌株P(guān)SB1、PSB4歸于紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)。如圖3所示，PSB2、PSB3與Rhodovulumsteppensestrain A-20s在同一分支上，相似度高達(dá)100%，親緣關(guān)系較近；PSB5與Rhodobactersphaeroidesstrain 2.4.1在同一分支上，序列比對(duì)結(jié)果相似性為100%。因此將菌株P(guān)SB2、PSB3歸于小紅卵菌屬(Rhodovulum)，將PSB5歸于紅桿菌屬(Rhodobacter)。

圖2 基于16S rDNA NJ法構(gòu)建PSB1和PSB4系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 基于16S rDNA NJ法構(gòu)建PSB2、PSB3和PSB5系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 光合細(xì)菌對(duì)底泥水體pH的影響

向污泥中分別添加0.1%、0.5%、1%的PSB1、PSB2，水體pH變化如圖4所示。當(dāng)試驗(yàn)時(shí)間超過6 d，向污泥中添加PSB時(shí)，光合細(xì)菌可以穩(wěn)定水體pH，保持水體理化性質(zhì)的穩(wěn)定，對(duì)水體pH緩沖效果隨著光合細(xì)菌接種量的增加而更加明顯。與對(duì)照組相比，水體pH一般可以升高0.3～0.5。不做任何處理的對(duì)照組，pH出現(xiàn)急劇降低，這可能與高溫下水體中溶氧的質(zhì)量濃度降低、厭氧微生物代謝活動(dòng)增強(qiáng)導(dǎo)致的酸堿度降低有關(guān)，光合細(xì)菌轉(zhuǎn)化硫化氫也可能是原因之一。

2.5 光合細(xì)菌對(duì)底泥水體CODMn的影響

分別用0%，0.1%，0.5%，1%的PSB1、PSB2處理污泥，每2 d測(cè)定一次，其CODMn質(zhì)量濃度隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低(圖5)。經(jīng)過10 d處理后，PSB1對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的CODMn去除率分別為78.26%，89.16%，86.21%，92.91%，PSB2對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的CODMn去除率分別為66.67%，73.54%，82.27%，81.23%。與對(duì)照組相比，添加光合細(xì)菌實(shí)驗(yàn)組的CODMn去除率增加，當(dāng)添加量為1%時(shí)，去除率達(dá)到最高；對(duì)于消除底部的CODMn，PSB1優(yōu)于PSB2。

圖4 PSB1(a)和PSB2(b)處理的底泥水體pH變化情況

圖5 PSB1(a)和PSB2(b)處理底泥水體CODMn質(zhì)量濃度變化

2.6 光合細(xì)菌對(duì)底泥水體硫化物的影響

用不同含量的PSB1、PSB2處理污泥，其硫化物含量逐漸降低(圖6)。PSB1處理10 d后，硫化物去除率分別為54.74%，69.12%，73.49%，79.61%。隨著接種量的增加，硫化物去除率相應(yīng)增加。PSB2處理10 d后，硫化物去除率分別為66.16%，69.91%，64.73%，50.67%。PSB1去除硫化物比PSB2更為穩(wěn)定，但PSB2在低質(zhì)量濃度(0.1%)就可以起到較好的作用，具有較好的應(yīng)用前景。

2.7 光合細(xì)菌對(duì)底泥水體氨氮的影響

添加光合細(xì)菌可有效降低污泥氨氮含量(圖7)。PSB1處理10 d后，氨氮去除率分別為83.80%，94.90%，96.91%，97.00%；PSB2處理10 d后，去除率分別為93.89%，95.42%，92.89%，84.52%。對(duì)于氨氮的轉(zhuǎn)化去除效果，PSB1優(yōu)于PSB2，并表現(xiàn)穩(wěn)定；PSB2對(duì)氨氮去除效果較差，但在低質(zhì)量濃度時(shí)效果較好，這可能與菌株的特性有關(guān)。

圖6 PSB1(a)和PSB2(b)處理底泥水體硫化物質(zhì)量濃度變化

圖7 PSB1(a)和PSB2(b)處理底泥水體氨氮質(zhì)量濃度變化

2.8 光合細(xì)菌對(duì)底泥水體的影響

3 討論

3.1 光合細(xì)菌對(duì)pH的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，光合細(xì)菌可以穩(wěn)定水體pH，且隨著添加量的增加，穩(wěn)定pH的效果越明顯。在成分復(fù)雜的底泥中，pH受很多因素影響。如：溫度升高或浮游生物數(shù)量增多會(huì)導(dǎo)致pH升高；厭氧微生物代謝活動(dòng)增強(qiáng)、有機(jī)質(zhì)大量分解時(shí)pH則會(huì)下降。光合細(xì)菌具有多種營養(yǎng)方式，在有機(jī)物充足的條件下，可以迅速降解 H2S等酸性物質(zhì)，起到穩(wěn)定水體pH的作用[5-6]。張偉珠等[7]研究光合細(xì)菌對(duì)斑點(diǎn)叉尾魚苗培育水體水質(zhì)因子的調(diào)控作用，結(jié)果表明，施加光合細(xì)菌可以維持水體pH的穩(wěn)定。

圖8 PSB1(a)和PSB2(b)處理底泥水體質(zhì)量濃度

3.2 光合細(xì)菌對(duì)COD的影響

在本試驗(yàn)中，光合細(xì)菌表現(xiàn)出很好的COD降解能力，底泥中CODMn降解率隨著添加比例的提高而增大。CODMn降解率達(dá)到最大的條件為添加了1%的PSB1，降解率為92.91%。COD是環(huán)境水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一，其大小基本反映了水體受到的有機(jī)污染情況。在環(huán)境修復(fù)、污水處理等方面，光合細(xì)菌具有很大的潛力，被應(yīng)用于各類污水處理行業(yè)。王有志等[8]對(duì)光合細(xì)菌處理中藥浸出液廢水的效果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明，廢水在經(jīng)過水解酸化預(yù)處理后，在光合細(xì)菌處理系統(tǒng)內(nèi)COD平均去除率達(dá)到90.7%。謝紅剛等[9]采用光合細(xì)菌處理啤酒廢水，結(jié)果表明，最佳菌液投加量為30 mL/L，COD去除率最高可達(dá)到80%。光合細(xì)菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)方面也被廣泛應(yīng)用。王冰等[10]探討了光合細(xì)菌對(duì)模擬海水養(yǎng)殖污水中COD的去除能力，結(jié)果顯示每100 mL污水投加200 mL光合細(xì)菌時(shí)COD 去除效果較好，可達(dá)到79.2%。易力等[11]利用固定化光合細(xì)菌對(duì)養(yǎng)殖水體進(jìn)行生物修復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，接種光合細(xì)菌后12 d，pH上升到8.8，養(yǎng)殖水體的COD值和氨氮值分別降低54.29%和80%。

3.3 光合細(xì)菌對(duì)硫化物的影響

作為較常用的氧化硫化物的微生物之一，光合細(xì)菌能以硫化物或硫代硫酸鹽作為電子供體，依靠體內(nèi)特殊的光合色素，從光中獲得能量進(jìn)行光合作用[12]。王夢(mèng)亮等[13]研究表明，將沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)和類球紅細(xì)菌(Rhodopseudomonassphaeroides)1∶1混合可有效降低鯉魚養(yǎng)殖池中硫化物質(zhì)量濃度，與對(duì)照組相比下降77.4%。袁盈波等[14]從寧海東壩養(yǎng)殖場(chǎng)底泥中分離獲得一株能以S、Na2S2O3和Na2S等多種含硫化合物作為無機(jī)電子供體的光合細(xì)菌，研究顯示，該菌株處理高質(zhì)量濃度硫化物的效果較為明顯，對(duì)畜禽廢水和魚粉廢水中硫化物去除率可分別達(dá)到68.55%和56.15%。本研究中，在投加了1%的PSB1之后，水體中硫化物的去除率達(dá)到79.61%，去除效果明顯。值得注意的是，在低投加量情況下，相較于PSB1，PSB2有著更好的去除效果，這可能與菌體結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。

3.4 光合細(xì)菌對(duì)氨氮的影響

在本試驗(yàn)中，添加1%的PSB1可以達(dá)到最大的氨氮去除率(97%)。氮源是光合細(xì)菌生長(zhǎng)的必要條件，所有的光合細(xì)菌能直接利用的氮源為銨鹽，有機(jī)氮可以經(jīng)過氨化作用轉(zhuǎn)化為氨氮，從而被光合細(xì)菌所利用。楊紹斌[15]用不同質(zhì)量濃度的光合細(xì)菌菌液處理鯉魚養(yǎng)殖水，結(jié)果表明，光合細(xì)菌混合液對(duì)魚塘水的氨氮去除效果明顯，去除率最高為88.89%。董艷珍等[16]對(duì)1株從養(yǎng)殖池塘底泥中分離獲得的光合細(xì)菌進(jìn)行研究，結(jié)果表明，1株光合細(xì)菌以使生活污水和養(yǎng)殖池塘肥水中的氨態(tài)氮分別降低66.6%和74.8%。黃雪嬌等[17]從云南某一沼澤地中分離篩選出1株可降解氨氮的光合細(xì)菌，試驗(yàn)結(jié)果表明，其為Rhodopseudomonas屬的一個(gè)新菌，投加0.4%的菌劑對(duì)模擬廢水中氨氮的去除率達(dá)99%以上。以上試驗(yàn)結(jié)果均表明光合細(xì)菌對(duì)于氨氮有著很好的降解性能。

3.5 光合細(xì)菌對(duì)的影響

4 結(jié)論

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