王錦霞 ，李碩 ，代春艷 ，馬龍彪 ，劉大麗

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150080；3.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150080）

0 引言

長(zhǎng)期累積并隱藏于土壤中的包括Cd、Zn、Cu等在內(nèi)的重金屬離子，當(dāng)它們含量達(dá)到或超過(guò)一定程度后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)生物大分子失活、阻礙蛋白質(zhì)功能或取代其它必需營(yíng)養(yǎng)元素，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育并對(duì)其產(chǎn)生毒害[1]。植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化適應(yīng)過(guò)程中也相應(yīng)地產(chǎn)生了一系列包括螯合、外排和區(qū)隔等在內(nèi)的作用機(jī)制以降低重金屬離子毒害。一般情況下，為了避免細(xì)胞傷害，植物會(huì)利用低分子量復(fù)合物螯合重金屬離子，進(jìn)而將其區(qū)隔到細(xì)胞器或通過(guò)特異的轉(zhuǎn)運(yùn)子排出到細(xì)胞間隙[2]。在眾多的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)子中，金屬耐受蛋白（Metal tolerance proteins，MTPs）作為植物中一類重要的陽(yáng)離子擴(kuò)散促進(jìn)子（Cation Diffusion Facilitator，CDF）家族成員，直接或間接地參與到重金屬離子的調(diào)控和代謝過(guò)程中。研究表明，無(wú)論是在擬南芥（Arabidopsis thaliana）還是超累積植物鼠耳芥（A rabidopsishalleri）或藍(lán)菜（Noccaea caerulescens）體內(nèi)，其液泡中大量的金屬離子的區(qū)隔均與MTPs的作用直接相關(guān)[3-4]。

通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化分析，在植物體內(nèi)，MTPs被劃分為七個(gè)小組。其中，Group 1、5、12小組屬于Zn-CDFs；Group 6、7小組屬于Fe/Zn-CDF家族；而Group 8、9小組被推測(cè)為Mn-CDFs家族[5-6]。大多數(shù)CDFs蛋白在N和C末端之間有6個(gè)左右的跨膜結(jié)構(gòu)域（Transmembrane domains，TMDs）。存在于第四、第五個(gè)TMD或者碳氮末端的高豐度組氨酸區(qū)域，被推測(cè)可能作為金屬結(jié)合域（Metal binding domain）與重金屬離子識(shí)別相關(guān)[7]。研究表明，隸屬于Group 1的AtMTP1、AtMTP3作為Zn的轉(zhuǎn)運(yùn)子在液泡中發(fā)揮功能[8]；而在Group 8和9中，AtMTP11定位于trans-Golgi或pre-vacuolar compartment[9]。在Mn離子脅迫下，只有AtMTP11基因呈現(xiàn)出大量的誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)該基因的缺失突變體對(duì)Mn高度敏感，并且在其葉片部位可以檢測(cè)到大量Mn離子的存在。過(guò)量表達(dá)AtMTP11基因同時(shí)可以提高酵母和擬南芥對(duì)Mn離子的耐受性[9-10]。由此可以推斷，AtMTP11可能通過(guò)囊泡的運(yùn)輸以及胞吐作用外排過(guò)量的Mn以降低重金屬離子帶來(lái)的細(xì)胞毒害。在水稻體內(nèi)，OsMTP11可以在不同程度上補(bǔ)償酵母突變體對(duì)于Mn、Co、Ni的敏感性，并且該基因的表達(dá)分別受到了Mn、Zn、Ni、Cd的誘導(dǎo)調(diào)控；通過(guò)洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，OsMTP11-GFP在液泡膜上的表達(dá)更為強(qiáng)烈，這也暗示了該基因參與重金屬離子的區(qū)隔化[11]。

甜菜是我國(guó)重要的糖料作物之一，重金屬逆境嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)發(fā)育以及品質(zhì)產(chǎn)量[12]。在前期的相關(guān)研究[13-14]，以及對(duì)甜菜在重金屬逆境脅迫下的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析過(guò)程中，本課題小組發(fā)現(xiàn)了一系列與重金屬逆境誘導(dǎo)相關(guān)的差異表達(dá)基因，其中，BvMTP11基因無(wú)論在甜菜葉片還是根部的表達(dá)都極其顯著。因此，為了進(jìn)一步了解BvMTP11在甜菜體內(nèi)的功能以及其在重金屬離子代謝平衡中的分子機(jī)制，本研究利用RT-PCR克隆了甜菜BvMTP11基因，并對(duì)該基因進(jìn)行了較為全面的生物信息學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

甜菜780016B/12優(yōu)，由國(guó)家甜菜種質(zhì)資源中期庫(kù)（國(guó)家甜菜種質(zhì)資源平臺(tái)）提供。取4片真葉期的甜菜幼苗組織，用于總RNA的提取以及基因克隆。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA的提取

稱取1 g甜菜幼苗組織，通過(guò)Trizol（Invitrogen）法提取甜菜的總RNA。利用紫外分光光度計(jì)NavoVue plus在OD260和OD280下，測(cè)定RNA濃度及純度。1.0%Agarose electrophoresis進(jìn)一步檢測(cè)RNA的質(zhì)量。

1.2.2 cDNA反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增

取1μg總RNA，利用First strand cDNA synthesis kit（TOYOBO）將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)甜菜Beta vulgaris metal tolerance protein 11（BvMTP11，LOC104886952）基因的堿基序列設(shè)計(jì)引物：[Forward primer(5′-3′):CGGGATCC(BamHI)A TGGGGGAAA TGGTCA GACTC;Reverse primer(5′-3′):CGCTCGAG(XhoI)C TAT AGA TGGGCT TGCGCA TG；Tm=65℃；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 242 bp]。以cDNA為模板，利用KOD-Plus-Neo高保真酶（TOYOBO）PCR擴(kuò)增該基因CDS全長(zhǎng)。

1.2.3BvMTP11基因的克隆

取4μL PCR產(chǎn)物，于25℃連接到載體pEASY-Blunt（TransGen）上，并轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中。通過(guò)IPTG誘導(dǎo)和X-gal底物顯色以及Amp抗性篩選，選擇陽(yáng)性重組子質(zhì)粒DNA，并利用BamHI和XhoI進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切和PCR鑒定。所獲得的陽(yáng)性克隆進(jìn)一步于上海生工測(cè)序，確定其序列的完整性。

1.2.4 生物信息學(xué)分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的ORF Finder分析BvMTP11基因的開放讀碼框和CDS，利用Conserved Domains Database（CDD）分析該基因所編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。利用ProtParam軟件計(jì)算目的蛋白的分子量和等電點(diǎn)。通過(guò)SignalP-5.0、ProtScale以及TMHMMServer 2.0分別來(lái)預(yù)測(cè)該蛋白的信號(hào)肽、親疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)域的分布情況。利用PSORT預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜BvMTP11基因的克隆

根據(jù)Beta vulgaris metal tolerance protein 11(BvMTP11，LOC104886952）基因的堿基序列，設(shè)計(jì)該基因CDS兩端的特異引物，并在起始密碼子和終止密碼子兩端分別引入BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)，以甜菜總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板擴(kuò)增目的基因。如圖1-A所示，經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)，甜菜總RNA具備了較高的完整性和純度。通過(guò)RT-PCR技術(shù)，利用高保真Taq酶擴(kuò)增BvMTP11基因，在1.24 kb左右的位置獲得了目的條帶（圖1-B）。此PCR產(chǎn)物與目的基因在Genbank里的序列大小相一致，無(wú)雜帶，可以直接用于下一步的載體構(gòu)建。將BvMTP11基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到克隆載體pEASY-Blunt上。研究表明，經(jīng)過(guò)大腸桿菌轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒的提取以及BamHI、XhoI限制性內(nèi)切酶酶切，在1%的Agarose凝膠的3.93 kb和1.24 kb的位置上，獲得了相對(duì)應(yīng)于載體pEASY-Blunt和目的基因片段BvMTP11的條帶（圖2-A）；同時(shí)，利用特異引物PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒，在大約1.24 kb左右的位置獲得了目的條帶（圖2-B）。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pEASY-Blunt-BvMTP11測(cè)序，通過(guò)與該基因的Genbank數(shù)據(jù)信息對(duì)比，最終確定了克隆的正確性。

圖1 甜菜BvMTP11基因的RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 RT-PCR amplification of BvMTP11 gene

2.2 甜菜BvMTP11基因的生物信息學(xué)分析

甜菜BvMTP11基因的CDS全長(zhǎng)為1 227 bp，編碼408個(gè)氨基酸（圖3）。根據(jù)ProtParam分析計(jì)算，該基因所編碼蛋白的分子量（Molecular weight）為45.935 kDa，等電點(diǎn)（Theoretical pI）為4.89。該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)（Instability index）為43.21，屬于不穩(wěn)定蛋白。根據(jù)SignalP-5.0分析該蛋白沒(méi)有信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白。

圖3 甜菜BvMTP11基因序列信息Fig.3 Beta vulgaris BvMTP11 gene sequence

根據(jù)ProtScale預(yù)測(cè)，BvMTP11基因所編碼蛋白的親水性最低值為-3.289，最高值3.122，因此推測(cè)該蛋白為親水性蛋白。利用TMHMMServer 2.0對(duì)該基因的蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，如圖4所示，該蛋白有5個(gè)跨膜螺旋區(qū)，橫跨細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)，屬于跨膜蛋白。PSORT預(yù)測(cè)該蛋白有80%的可能性定位于過(guò)氧化物酶體。NCBI保守結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)CDD分析發(fā)現(xiàn)，在BvMTP11蛋白的C末端附近存在陽(yáng)離子排出域（Cation efflux domain）（圖5）。這些結(jié)構(gòu)暗示了該基因可能作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與到甜菜重金屬離子的解毒代謝過(guò)程中。

圖4 甜菜BvMTP11蛋白的跨膜螺旋區(qū)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of transmembrane helices in BvMTP11

圖5 BvMTP11蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.5 Conserved domain assay of BvMTP11

3 討論

逆境脅迫過(guò)程中，離子代謝平衡對(duì)于植物細(xì)胞至關(guān)重要。生物體內(nèi)有許多基因家族都參與到重金屬離子的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中[15]。在植物中，MTPs是一類重要的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)子。然而，與包括轉(zhuǎn)錄因子以及激酶在內(nèi)的其他基因家族相比，MTPs在重金屬逆境脅迫過(guò)程中的特性及功能還有待更加深入的了解。

重金屬逆境會(huì)導(dǎo)致甜菜的生長(zhǎng)發(fā)育在一定程度受到影響[12]。前期通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)RNA-Seq的分析發(fā)現(xiàn)，在脅迫應(yīng)答過(guò)程中，甜菜BvMTP11基因的表達(dá)極其顯著。因此，本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆了BvMTP11，并結(jié)合生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析和預(yù)測(cè)了該基因的生物學(xué)結(jié)構(gòu)和特性。由于MTPs屬于陽(yáng)離子擴(kuò)散促進(jìn)家族（Cation diffusion facilitator family，CDF）。CDF家族成員一般有幾個(gè)獨(dú)特的結(jié)構(gòu)：1個(gè)N端的特異信號(hào)序列、4～6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（Transmembrane domains，TMDs）、1個(gè)富含組氨酸的胞質(zhì)環(huán)（Cytoplasmic loop）、1個(gè)大的陽(yáng)離子排出域（Cation efflux domain）以及質(zhì)膜碳末端（Cytoplasmic C-terminus）[16]。因此，甜菜BvMTP11蛋白的離子外排結(jié)構(gòu)域以及5個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域的存在也說(shuō)明了該基因具備了重金屬離子結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)的功能。同時(shí)，該基因的全長(zhǎng)CDS序列的克隆也為下一步深入細(xì)致研究其在重金屬逆境脅迫下的底物特性、亞細(xì)胞定位、組織學(xué)表達(dá)特性奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步提高甜菜對(duì)重金屬逆境的耐受性以及利用生物技術(shù)來(lái)改造或在生物修復(fù)方面的應(yīng)用提供了候選基因。