王凱琪，王珺華，王 凱，常 裕，孫志宏，2，齊向英*

(1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心，陜西延安716000)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)屬于毛茛科芍藥屬[1]，花形較大、花色美麗。自我國唐朝以來就有 “花中之王”的稱號，是我國原產(chǎn)的特色花卉。自古以來，人們就鐘愛牡丹。我國分布的牡丹種類主要有紫斑牡丹(PaeoniaRockii)，黃牡丹(Paeoniadelavayivar.lutea)和矮牡丹(Paeoniasuffruticosavar.spontaneareha)[2]。矮牡丹(Paeoniasuffruticosavar.spontaneareha)屬于毛茛科芍藥屬，為牡丹的一個變種，是國家三級瀕危保護物種。

延安市萬花山從1976年開始建立了延安牡丹保護區(qū)。該區(qū)內(nèi)以花色分類保存了延安矮牡丹的“延州白”、“延州粉”、“白玉仙”等14個不同品種；保存了“雙塔粉荷”等21個紫斑牡丹品種[3]。萬花山區(qū)矮牡丹與紫斑牡丹的主要區(qū)別為矮牡丹葉背面和葉軸均生短柔毛，二回羽狀復(fù)葉，頂生小葉寬卵圓形或近圓形，長4～6 cm，寬3.5～4.5 cm，3裂至中部，裂片再淺裂。

延安地區(qū)分布的矮牡丹適應(yīng)了黃土高原的貧瘠土壤，既能在樹木林緣生長，也能在山地、塬地、坡地生長。由于其生長年限很長，往往和同期栽培其他牡丹品種相比較植株矮小，生長緩慢。矮牡丹也是全國各地移栽后唯一對牡丹白粉病有較強抗性的品種。近年來，山東、河南、山西等省和陜西的西安、綏德、子長、寶雞、眉縣等地區(qū)均從延安引種矮牡丹進行引種栽培。

圖1 延安地區(qū)野生“延州白”矮牡丹圖

2010年起延安大學(xué)和西北農(nóng)林科技大學(xué)合作開始研究延安矮牡丹的快速繁殖和在牡丹新品種培育中的應(yīng)用。2012年延安大學(xué)用矮牡丹葉片誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)成功[4]。為了進一步確定矮牡丹葉片誘導(dǎo)系的穩(wěn)定性，本研究選擇了以延安地區(qū)野生的“延州白”矮牡丹系作為材料(如圖1所示)，確定其核型的各項信息。

核型分析有利于揭示物種遺傳進化的過程機制，本文通過對矮牡丹的幼嫩葉片染色體數(shù)目及核型的研究[5-7]，為矮牡丹在育種中的運用提供細胞學(xué)和遺傳學(xué)依據(jù)，旨在對于這一珍稀種質(zhì)資源的保存和利用做進一步的了解。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

供試材料于2017年3月8號、2018年3月8號以及2019年3月8號在延安萬花山的東坡牡丹園采取，選擇生長正常的幼嫩葉片。

1.2 藥品與儀器

藥品：0.1%的秋水仙堿溶液，卡諾氏固定液V冰醋酸：V95%乙醇=1∶3)，1 mol/L的HCl溶液，45%的冰醋酸，0.075 mol/L的KCl溶液，改良的苯酚品紅溶液。

儀器：電熱恒溫水浴鍋，Olympus BX51全自動顯微照相系統(tǒng)。

1.3 實驗方法

取材：在早晨8點前配置好0.1%的秋水仙堿溶液，帶到取材地點，用剪刀直接剪取矮牡丹莖上的萌動芽。

預(yù)處理：投入0.1%的秋水仙堿溶液中，帶回實驗室。秋水仙堿連續(xù)處理4 h，以便積累較多的有絲分裂中期的細胞數(shù)。

固定：秋水仙堿處理結(jié)束后直接投入配置好的卡諾氏固定液中固定12 h，殺死組織有效的固定分裂相。從固定液中取出后用蒸餾水泡洗3次，每次3～5 min，然后轉(zhuǎn)入75%乙醇溶液中，在4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

解離：將保存的材料從75%乙醇中取出，用蒸餾水連續(xù)泡洗3次，每次3 min。將配置好的1 mol/L HCl加入到指管中，放入水浴鍋，當(dāng)水浴鍋溫度顯示60 ℃時，用溫度計測量指管中的溫度，根據(jù)指管中的溫度調(diào)節(jié)水浴鍋的溫度，使指管內(nèi)的溫度達到并穩(wěn)定維持在60 ℃。將清洗好的材料用解剖刀沿橫莖切開，投入到溫度恒定的HCl溶液中，解離5 min。在解離的過程中，如果材料表面有氣泡冒出，立即停止解離，并將材料迅速轉(zhuǎn)入1 mol/L HCl常溫溶液中。

低滲：將解離完成的材料放入蒸餾水中連續(xù)泡洗5次，每次3 min。主要目的是清洗掉多余的HCl溶液，然后投入配置好的0.075 mol/L KCl溶液中，常溫下保持30 min。

染色：將低滲完成的材料整體投入改良苯酚品紅溶液中染色30 min[8]，取出材料，將材料在載玻片上分割成肉眼可以觀察到的大小。

壓片：采用壓片法，將材料移動到載玻片中央，在材料上滴一滴45%的冰醋酸。從材料一側(cè)將蓋玻片緩慢放到材料上，保證冰醋酸溶液在蓋玻片和載玻片之間無氣泡產(chǎn)生。將吸水紙覆蓋在蓋玻片上面，在材料位置用帶橡皮的鉛筆橡皮端敲擊或者用大拇指用力從材料位置壓下，保證蓋玻片不移動。

選片與拍照：挑選出分散良好、染色清晰的片子，并將其放在OlympusBX51全自動顯微鏡下進行觀察，尋找染色相對較為清晰、分散卻不重疊的分裂中期細胞進行拍照，得到各組照片。

染色體數(shù)目統(tǒng)計：只有對植物細胞中含有的染色體數(shù)目進行統(tǒng)計分析后我們才能確定植物的染色體數(shù)目[9]。由于存在統(tǒng)計上的差異，因此許多人認(rèn)為至少統(tǒng)計30個細胞(染色體清晰可見且分布均勻)，常認(rèn)為只要85%以上的細胞具有相同的染色體數(shù)時，才可以確定該植物染色體數(shù)目。

染色體形態(tài)：關(guān)于染色體的形態(tài)分析[10]，在顯微鏡視野中尋找分散良好的中期細胞染色體進行拍照，經(jīng)過放大后然后彩印，用細繩(相比較精準(zhǔn))測量每條染色體的長短臂的相對長度，按照放大倍數(shù)求出其絕對長度；或者用測微尺測量絕對長度，染色體的隨體不記長度，找到著絲粒的位置；再求出臂比、絕對長度和相對長度。在進行同源染色體的配對時需要根據(jù)染色體的長度、臂比、隨體以及著絲粒的位置等數(shù)據(jù)進行配對。對染色體進行編號時，1號為最長的染色體，尾號為最短的染色體。若存在長度相同的染色體時，把染色體短臂長的排在前面，再將配對好的同源染色體按從小到大的編號排列在紙上且粘好，在排列時把染色體的著絲粒放在一條直線上，染色體的短臂放在上邊，長臂放于直線以下，排放整齊后對其進行拍照，就可以得到染色體核型圖，然后按照核型圖繪制染色體的核型模式圖，然后對染色體進行測量以及數(shù)據(jù)分析。

核型分析方法：按照李懋學(xué)、陳瑞陽等標(biāo)準(zhǔn)來確定染色體的數(shù)目以及分析染色體的形態(tài)[11]，按照Stebbins的方法確定染色體核型的類別[12]，經(jīng)過壓片法和圖像處理共分析了60個有效細胞分裂相。

按照文獻中提出的核型不對稱系數(shù)確定染色體核型的不對稱程度，染色體的核型不對稱系數(shù)(As.K/%)按Arano的方法計算[13，14]，可根據(jù)表1的臂比值的范圍確定染色體著絲點位置，進一步確定染色體類型。

染色體形態(tài)測量公式：

相對長度=(染色體長度/染色體組總長度)×100%

著絲粒指數(shù)=(短臂/染色體全長)×100%

臂比=長臂/短臂

核型不對稱系數(shù)(As.K%)=(長臂總長/全組染色體總長)×100%

表1 染色體臂比值、著絲點位置與染色體類型

2 分析

2.1 染色體數(shù)目

本實驗按照李懋學(xué)、陳瑞陽建議的核型分析的標(biāo)準(zhǔn)，在矮牡丹的大量制片中觀察了60個細胞分裂相，如表2、3所示。其中共計51個細胞均含有10條染色體，所占比例為85%，達到染色體數(shù)目所要求的85%，95%的置信區(qū)間為78.5%～88.20%，置信區(qū)間間隔過大，寬窄度為寬，所以結(jié)果顯著；7個細胞各含有9條染色體，所占比例為11.67%，95%的置信區(qū)間為8.9%～17.72%，雖然置信區(qū)間達到要求，但細胞數(shù)量過少，未達到要求的85%的細胞數(shù)量；2個細胞各含有8條染色體，所占比例為3.33%，95%的置信區(qū)間為1.01%～5.65%，細胞數(shù)量和置信區(qū)間均未達到要求。因此確定矮牡丹的染色體數(shù)目為10條。

表2 染色體數(shù)目及置信區(qū)間

表3 顯著性分析

2.2 長度與核型分析

由表4可見，矮牡丹染色體的相對長度范圍為6.71%～10.01%，矮牡丹最長與最短染色體長度比值為1.49，臂比大于2∶1的染色體有1組，所占比例大于20%，兩項主要特征可以判斷矮牡丹屬于2A型。核型不對稱系數(shù)為62.43%。在配對的染色體中，m類型染色體有4組，st型染色體有1組。所以，矮牡丹染色體核型公式為2n=2x=10=8m+2st。核型圖見圖2，核型模型圖見圖3。

表4 染色體相對長度、臂比與類型

圖2矮牡丹染色體

圖3 矮牡丹染色體核型模型圖

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

3.1.1 材料選擇

本研究選擇的是矮牡丹幼嫩葉片而不是以根作為材料，因為幼嫩葉片已經(jīng)是特化器官，相對根穩(wěn)定性更高，變異的可能性不是很大，因此選擇矮牡丹幼嫩葉片作為材料。

3.1.2 解離、制片

解離時需要水浴加熱，使溫度持續(xù)處于60 ℃，目的是為了保持恒溫，加速解離[15]，解離時間為5 min。在解離過程中一定要掌握好溫度和時間，若解離溫度不夠，則壓片不易分散，若解離時間過長，在下一步處理時會由于材料過軟而容易將根尖部位丟失。

制片質(zhì)量的好壞直接會影響實驗結(jié)果，因此，在做實驗的過程中必須根據(jù)自身情況采用各自的制片方式，壓片法和涂片法是我們最常用的制片方式[16]。涂片法是先用鑷子、解剖針等將材料弄碎，讓細胞均勻分布在載玻片上，但很難觀察到染色體或比較模糊。相比之下，由于壓片法容易操作，而且觀察到的染色體比較清晰，所以本次實驗選擇壓片法制片。

3.1.3 染色體數(shù)目

染色體數(shù)目統(tǒng)計一般以體細胞染色體數(shù)目為準(zhǔn)，統(tǒng)計的細胞數(shù)目應(yīng)在30個以上，其中85%以上的細胞具有恒定一致的染色體數(shù)，即可認(rèn)為是該植物的染色體數(shù)目。該實驗觀察了60個細胞分裂相，有51個細胞分裂相觀察到的染色體數(shù)目為10條，7個細胞各含有9條染色體，2個細胞各含有8條染色體，造成染色體數(shù)目缺少的原因可能是因為壓片過程中，兩條或兩條以上的染色體連成一條線很難區(qū)分出來，所以認(rèn)為矮牡丹的染色體數(shù)目為10條。

3.1.4 核型

一個體細胞中的全部染色體，按照其大小、形態(tài)特征、著絲粒位置等順序排列所構(gòu)成的圖像即為核型。根據(jù)Stebbins的核型不對稱性分類標(biāo)準(zhǔn)[17]，侯小改等對部分牡丹品種的染色體核型進行分析[18]，這些牡丹均屬于2A型。該實驗證明矮牡丹也是2A型。

3.2 結(jié)論

本次實驗從制作的矮牡丹染色體切片中觀察了60個細胞并進行染色體計數(shù)，確定其染色體數(shù)目為10，且染色體基數(shù)都是X=5，這與其他人得出的染色體數(shù)目的觀察結(jié)果一致[19～20]。確定矮牡丹染色體核型公式為：2n=2x=10=8m+2st。

根據(jù)Stebbins 1971年的核型不對稱性分類標(biāo)準(zhǔn)來看，可以判斷矮牡丹屬于2A型。經(jīng)過計算，矮牡丹的核型不對稱系數(shù)為62.43%，核型不對稱系數(shù)的大小反應(yīng)了核型不對稱程度，而核型不對稱程度是進化的一種標(biāo)志，因而不對稱系數(shù)越大，則進化水平越高。由此可以看出矮牡丹的進化水平不是特別高，這則給我們在保護矮牡丹上提供了一個新的方向，就是如何提高矮牡丹的核型不對稱程度。