糜磊，武丹，陶清，周月鵬，陳德玉

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江212001)

胃癌化療抵抗形成的原因之一在于腫瘤細(xì)胞較強(qiáng)的凋亡抵抗能力，導(dǎo)致化療效果減弱以及失敗后的再增殖、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等進(jìn)程[1]。已有研究[2～4]證實(shí)，在多種腫瘤細(xì)胞中乙酰輔酶A合成酶2(ACSS2)可通過將乙酸鹽、輔酶A以及三磷酸腺苷(ATP)等生成乙酰輔酶A，參與腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等。但在不同研究[5，6]中ACSS2表達(dá)強(qiáng)度對(duì)腫瘤預(yù)后以及治療拮抗的影響尚存在較大爭議。核因子κB(NF-κB)即p65，它的激活形式是磷酸化后形成p-p65，當(dāng)前眾多研究指出，作為抗凋亡轉(zhuǎn)錄因子，它的激活會(huì)誘導(dǎo)許多抗凋亡因子產(chǎn)生，比如B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白(Bcl-2)、B細(xì)胞淋巴瘤-特大型蛋白(Bcl-xL)[7, 8]，同時(shí)也會(huì)下調(diào)凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)的X蛋白(Bax)的表達(dá)[9]。我們觀察了ACSS2低表達(dá)的人胃癌細(xì)胞株MGC80-3順鉑(DPP)敏感性，旨在揭示ACSS2在胃癌DDP抵抗效應(yīng)形成的具體作用。

1 材料與方法

1.1 ACSS2、細(xì)胞及試劑 ACSS2購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，人胃癌細(xì)胞株MGC80-3、AGS、SGC-7901、NCI-N87以及正常胃黏膜上皮細(xì)胞系RGM-1購自于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司， 均用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞所用NC及siRNA-ACSS2購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，轉(zhuǎn)染siRNA均為標(biāo)準(zhǔn)步驟，siRNA-ACSS2正義鏈5′-UAUGCUUGGUGACAGGCUCAUCUCC-3′；反義鏈5′-GGAGAUGAGCCUGUCACCAAGCAUA-3′；NC：正義鏈5′-GCGACGAUCUGCCUAAGAUdTdT-3′；反義鏈5′-AUCUUAGGCAGAUCGUCGCdTdT-3′。RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Gibco公司，DPP購自上海Selleck公司，CCK-8試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，Bcl-2、Bcl-xL、Bax、p65、p-p65以及β-Actin單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 MGC80-3、AGS、SGC-7901、NCI-N87及RGM-1細(xì)胞ACSS2蛋白檢測 采用Western blotting法。取對(duì)數(shù)生長期MGC80-3、AGS、SGC-7901、NCI-N87及RGM-1細(xì)胞，離心測定蛋白濃度后加入上樣緩沖液，煮沸10 min變性處理。經(jīng)聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳后，將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉60～90 min后置于稀釋好的ACSS2(1∶1 000配置)抗體稀釋液中4 ℃冰箱孵育過夜；再次洗滌后加入抗鼠或抗兔HRP標(biāo)記二抗室溫孵育60 min，清洗加入曝光液顯影、拍攝并利用藍(lán)翔化學(xué)分析軟件分別測定目的蛋白及β-Actin的灰度值，目的蛋白與對(duì)應(yīng)β-Actin灰度值之比即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，重復(fù)3次，取平均值。

1.3 MGC80-3細(xì)胞分組、siRNA轉(zhuǎn)染及DDP給藥方法 對(duì)數(shù)生長期MGC80-3細(xì)胞分為A、B、C、D組，B及D組分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染小干擾RNA(siRNA)實(shí)驗(yàn)，加入10 μL脂質(zhì)體Lipofectamine 2000+5 μL siRNA-ACSS2轉(zhuǎn)染， C組加入及A組分別加入50 μL無血清純RPMI1640培養(yǎng)基+5 μL 陰性對(duì)照(NC)；A、B組均培養(yǎng)72 h，C組培養(yǎng)48 h時(shí)加入5 μg/mL的DDP繼續(xù)處理24 h，D組轉(zhuǎn)染48 h時(shí)加入5 μg/mL的DDP繼續(xù)處理24 h。

1.4 各組MGC80-3細(xì)胞增殖活力檢測 采用CCK8法。取各組細(xì)胞，每組6個(gè)復(fù)孔，每孔加入10 μL的CCK8，震蕩、孵育1～2 h后在酶聯(lián)檢測儀450 nm 波長下檢測各組OD值，按細(xì)胞增殖活力(%)=(OD處理組-OD空白組)/(OD對(duì)照組-OD空白組)×100%公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力。OD處理組為B、C組孔的OD值；OD空白組為只含培養(yǎng)基和CCK8溶液而無細(xì)胞的孔的OD值；OD對(duì)照組為A、D組孔的OD值。

1.5 各組凋亡MGC80-3細(xì)胞檢測 采用流式細(xì)胞分析術(shù)。取各組細(xì)胞，用不含EDTA胰酶消化離心后用預(yù)冷的PBS洗2次，每管用500 μL標(biāo)記緩沖液重懸，避光下先加入5 μL的Annexin V-FITC，待臨上機(jī)前15 min加入10 μL PI，用流式細(xì)胞儀觀察各組細(xì)胞凋亡情況。

1.6 各組細(xì)胞ACSS2、p65、p-p65、Bcl-2、Bcl-xL、Bax蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組細(xì)胞，所有操作均同“1.2”，重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 MGC80-3、AGS、SGC-7901、NCI-N87及RGM-1細(xì)胞ACSS2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 MGC80-3、AGS、SGC-7901、NCI-N87及RGM-1細(xì)胞ACSS2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.80±0.03、0.62±0.04、0.60±0.04、0.72±0.05、0.41±0.04。與RGM-1細(xì)胞比較，MGC80-3、AGS、SGC-7901、NCI-N87細(xì)胞ACSS2相對(duì)表達(dá)量升高(P均<0.01)；MGC80-3細(xì)胞ACSS2相對(duì)表達(dá)量比其余胃癌細(xì)胞高，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇MGC80-3細(xì)胞進(jìn)行。

2.2 各組細(xì)胞增殖活力比較 A、B、C、D組細(xì)胞增殖活力分別為98.67%±4.89%、92.67%±7.86%、62.67%±4.05%、34.67%±7.61%，A組與B組相比無明顯差異(P>0.05)；與A組比較，C組細(xì)胞增殖活力下降(P<0.001)；與B、C組比較，D組細(xì)胞增殖活力均下降(P均<0.001)。

2.3 各組細(xì)胞凋亡情況比較 A、B、C、D組早期細(xì)胞凋亡率分別為1.06%±0.02%、1.13%±0.08%、7.62%±0.55%、14.33%±0.21%，晚期細(xì)胞凋亡率分別為8.01%±0.05%、8.13%±0.06%、10.81%±0.43%、15.98±0.18%。與A組比較，C、D組細(xì)胞早、晚期凋亡率均升高(P均<0.05)；與B組比較，D組早、晚期凋亡率均升高(P均<0.05)；與C組比較，D組細(xì)胞早、晚期凋亡率均升高(P均<0.05)。

2.4 各組細(xì)胞ACSS2、p65、p-p65、Bcl-2、Bcl-xL、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 見表1。與A組比較，C組p-p65、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，Bcl-2、Bcl-xL相對(duì)表達(dá)量降低(P均<0.05)；與B組比較，D組細(xì)胞p65、p-p65、Bcl-2、Bcl-xL相對(duì)表達(dá)量均降低、Bax相對(duì)表達(dá)量升高(P均<0.05)。

表1 各組MGC80-3細(xì)胞ACSS2、p65、p-p65、Bcl-2、Bcl-xL、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

胃癌目前以手術(shù)、放療及化療的綜合治療為主要干預(yù)手段，但受限于早期轉(zhuǎn)移、治療拮抗等因素，5年生存率僅在15%～30%[1, 2, 10, 11]。化療在胃癌綜合治療方案中有著至關(guān)重要的作用，其中DPP作為常見一線治療用藥而被廣泛應(yīng)用，然而抵抗效應(yīng)的產(chǎn)生造成治療失敗也制約了化療藥物在臨床的使用。

ACSS2是一種將乙酸鹽轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A的代謝酶，直接參與到細(xì)胞能量代謝以及物質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時(shí)因其可以影響組蛋白乙?；M(jìn)程進(jìn)而可以發(fā)揮表觀遺傳學(xué)修飾，調(diào)控細(xì)胞特別是腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為：腎癌組織中ACSS2表達(dá)強(qiáng)度要遠(yuǎn)高于癌旁正常組織，同時(shí)腎癌細(xì)胞通過促進(jìn)LAMP1蛋白表達(dá)促進(jìn)侵襲、轉(zhuǎn)移發(fā)生[5]；在腫瘤細(xì)胞中ACSS2調(diào)控乙酸鹽攝取和利用進(jìn)而參與脂質(zhì)合成以及組蛋白乙酰化等進(jìn)程[12]；在腫瘤特定微環(huán)境下如低氧、脂質(zhì)缺乏等條件下，腫瘤細(xì)胞通過激活A(yù)CSS2表達(dá)來維持其增殖活力[13]；在膀胱癌中ACSS2可能通過參與脂質(zhì)代謝最終影響順鉑耐藥形成，可以作為潛在預(yù)后判斷的標(biāo)記[3, 4]。因此探討ACSS2在胃癌化療敏感性中的作用、相關(guān)機(jī)制并尋找可以逆轉(zhuǎn)耐藥形成的潛在靶點(diǎn)，顯然對(duì)有效提高治療效果和患者生存率具有重要的臨床價(jià)值。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞株中ACSS2的表達(dá)強(qiáng)度更高，可見其在胃癌細(xì)胞中擔(dān)負(fù)著十分重要的作用。通過CCK8及流式細(xì)胞學(xué)分析發(fā)現(xiàn)干擾ACSS2表達(dá)之后對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡情況無明顯影響，但結(jié)合順鉑處理后發(fā)現(xiàn)，干擾ACSS2表達(dá)會(huì)導(dǎo)致胃癌細(xì)胞增殖活力明顯下降，并且凋亡率顯著升高。結(jié)合上述不同類型腫瘤中ACSS2的作用，我們猜測胃癌細(xì)胞中ACSS2表達(dá)可能參與化療敏感性調(diào)節(jié)。胃癌細(xì)胞中靶向下調(diào)ACSS2表達(dá)可以抑制p-p65的形成，NF-κB作為核轉(zhuǎn)錄因子，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中其活化形式p-p65的形成、轉(zhuǎn)位參與到胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、治療拮抗等多個(gè)生物學(xué)效應(yīng)[1, 14]。已有研究[10,11]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)胃癌細(xì)胞高表達(dá)抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xL等，抑制促凋亡相關(guān)蛋白如Bax生成時(shí)，可對(duì)順鉑、紫杉醇等化療藥物產(chǎn)生抵抗效應(yīng)，而這一進(jìn)程涉及到復(fù)雜的分子相互作用。在本實(shí)驗(yàn)中通過干擾ACSS2表達(dá)而抑制p-p65形成的同時(shí)Bcl-2蛋白表達(dá)量也出現(xiàn)了下調(diào)， 結(jié)合順鉑處理后，進(jìn)一步證實(shí)siRNA-ACSS2處理促進(jìn)了促凋亡蛋白Bax的生成。

綜上所述， 人胃癌細(xì)胞株ACSS2高表達(dá)。ACSS2低表達(dá)的MGC80-3細(xì)胞DDP敏感性升高。ACSS2可能通過調(diào)控NF-κB信號(hào)通路及Bcl-2、Bcl-xL、Bax蛋白的表達(dá)提高M(jìn)GC80-3細(xì)胞的DDP敏感性。ACSS2可能通過參與NF-κB活化及下游凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)來調(diào)控胃癌細(xì)胞DDP敏感性，但其具體作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。