于克，王祝榮

(揚州大學附屬醫(yī)院，江蘇揚州225000)

子宮內膜異位癥(Endometriosis, EMs)是一種雌激素依賴性的婦科疾病，其特征在于子宮內膜組織異位于子宮腔外，最常見于盆腔腹膜和卵巢，隨激素水平發(fā)生月經周期變化[1]。10%左右的育齡婦女患有EMs，其中30%左右患者無臨床癥狀，40%左右患者不孕，其余患者常見痛經、慢性盆腔疼痛。EMs是一種慢性疾病，可導致盆腔疼痛、不孕癥和反復手術等嚴重并發(fā)癥，嚴重降低患者生活質量和增加患者經濟負擔。異位子宮內膜組織轉變?yōu)閻盒越M織的風險較高，手術治療可以緩解EMs患者的疼痛，但75%的患者術后2年內即癥狀復發(fā)，激素干預治療后不良反應較嚴重[2，3]。EMs的病因、發(fā)病機制和病理生理學目前仍尚未完全了解，因此研究EMs發(fā)病的分子機制對指導臨床治療具有重要意義。Wnt/β-catenin通路是調控細胞增殖、侵襲轉移的重要信號通路之一，β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是Wnt/β-catenin信號通路中的樞紐，β-catenin的靶基因之一是cMYC原癌基因。轉化生長因子β1(Transforming Growth Factor beta1, TGF-β1) 是一種必需的生長因子，負責調節(jié)細胞增殖、分化、血管生成和免疫反應[4，5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，EMs患者異位子宮內膜組織TGF-β1高表達，在EMs的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用。但TGF-β1在EMs發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機制仍未完全明確。2017年6月～2018年12月，我們觀察了EMs患者異位子宮內膜組織TGF-β1mRNA的表達變化，觀察加入TGF-β1及其抑制劑培養(yǎng)的 ESCs細胞增殖、侵襲能力變化，并探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 cDNA反轉錄、qRT-PCR試劑盒等均購自日本TaKaRa公司；TGF-β1、內參GAPDH引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；IV型膠原酶、DNA酶、波形蛋白、角蛋白抗體和免疫熒光二抗購自美國Sigma公司；Triton X-100、DAPI和抗熒光淬滅封片劑購自上海碧云天生物技術有限公司；DMEM / F12培養(yǎng)基和FBS購自美國Gibco公司； TGF-β1因子購自美國Peprotech公司；TGF-β1抑制劑Ly364947購自美國Abmole公司；MTS試劑盒均購自南京凱基生物技術有限公司；boyden基質膠購自美國BD公司；Transwell小室、96孔板、培養(yǎng)瓶等購自美國Coring公司；RIPA蛋白裂解液及BCA檢測蛋白濃度試劑盒均購自美國Thermo公司；cMYC、β-catenin和GAPDH抗體均購自英國Abcam公司。

1.2 EMs患者異位子宮內膜組織、正常子宮內膜組織TGF-β1mRNA檢測 收集2015年1月～2018年12月入住我院進行手術治療的EMs患者手術切除EMs標本100例份，患者術前未接受激素或GnRH-α激動劑治療。另取同一時期未患有EMs但因子宮腺瘤等良性疾病來我院治療獲得的正常子宮內膜組織40例份作為對照。將組織標本冷凍于-80 ℃。所有患者簽署知情同意書，根據(jù)赫爾辛基宣言和我院倫理進行上述操作。

采用 qRT-PCR法檢測TGF-β1mRNA。TRIzol完全裂解組織或細胞，采用異丙醇方法提取總RNA，測取RNA濃度，逆轉為cDNA。設計合成TGF-β1上游引物為5′-ATCCATGTGTGACCATGAGGAAATG-3′,下游引物5′- TCGGCTAGTTAGGGTACACTTC-3′。內參GAPDH上游引物 5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′, 下游引物5′-GCCCAATACGACCAAATCC- 3′。以cDNA作為模板進行以95 ℃預變性5 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt代表TGF-β1mRNA的相對表達量，重復3次，取平均值。

1.3 ESCs分離、培養(yǎng)和鑒定 取異位子宮內膜新鮮組織，無菌生理鹽水將子宮異位內膜組織中血液洗去后，將組織剪成碎塊置于含2 mg/mL Ⅳ型膠原酶和100 μg/ mL的DNA酶中消化組織，37 ℃以100 rpm搖動60 min，70 μm孔徑無菌尼龍網過濾未消化組織，將過濾的細胞在燒瓶中附著30 min，用PBS洗去血細胞、組織碎片和上皮細胞，將ESCs接種在含有10% FBS的DMEM / F12培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

取對數(shù)生長期的ESCs以1×105細胞接種于6孔板中的細胞爬片上，細胞融合度為95%左右時，免疫熒光染色法鑒定ESCs。熒光顯微鏡下可見可見培養(yǎng)的ESCs細胞形態(tài)呈長梭形，符合ESCs的形態(tài)特征，培養(yǎng)的ESCs細胞幾乎全部表達ESCs陽性標記物波形蛋白(vimentin)蛋白，幾乎不表達ESCs陰性對照的上皮細胞標記物角蛋白(keratin)，表明本研究中培養(yǎng)的ESCs符合要求可進行后續(xù)研究。

1.4 ESCs細胞分組及TGF-β1處理 取對數(shù)生長期ESCs以每孔1×105細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，分為1、2、3、4組，每組6個復孔。待細胞貼壁后1、2組分別加入終濃度為2 ng/mL的TGF-β1因子、4 μL PBS(TGF-β1因子配制溶劑),3、4組分別加入終濃度為1 μmol/L的Ly364947、2 μL的DMSO(Ly364947配制溶劑)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 各組細胞TGF-β1mRNA檢測 采用 qRT-PCR法檢測各組細胞TGF-β1mRNA。取培養(yǎng)48 h時各組細胞，所有操作均同“1.2”，重復3次，取平均值。

1.6 各組細胞增殖情況觀察 采用MTS法。取對數(shù)生長起各組細胞，每孔2 000個細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0、24、48、72 h時棄掉培養(yǎng)基，每孔加入100 μL MTS試劑(MTS試劑:培養(yǎng)基=1∶5)放置細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，采用全波長掃描儀測取樣品490 nm處的光密度OD值。以OD值代表細胞的增殖能力。重復3次，取平均值。

1.7 各組細胞侵襲能力檢測 采用Boyden實驗。培養(yǎng)48 h時取各組細胞，無血清DMEM/F12培養(yǎng)基洗3次后計數(shù)，以5×104個細胞接種于Transwell小室聚碳酸酯微孔膜的BD基質膠上，下室加10% FBS的DMEM / F12培養(yǎng)基500 μL作為趨化因子，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細胞穿過情況，PBS洗聚碳酸酯微孔膜3次后甲醇固定10 min，結晶紫染色，顯微鏡下隨機計數(shù)3個視野穿過的細胞，其均值代表細胞侵襲能力。重復3次，取平均值。

1.8 各組細胞β-catenin、cMYC蛋白檢測 采用Western blotting法。培養(yǎng)48 h時取各組細胞，PBS洗3次后，加入RIPA蛋白裂解液將細胞斑塊吹散，超聲冰上裂解30 min，14 000 r/min、4 ℃離心30 min去除細胞碎片，上清移至新的EP管中，即為蛋白裂解液，測定蛋白濃度后加入loading試劑，煮沸變性進行蛋白上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕轉，5%BSA室溫封閉2 h，加入一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，TBST洗3次后，室溫孵育二抗1 h，ELC化學發(fā)光法顯示條帶。以目的蛋白灰度值表示目的蛋白的相對表達量。重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 EMs患者異位子宮內膜組織、正常子宮內膜組織TGF-β1mRNA相對表達量比較 EMs患者異位子宮內膜組織、正常子宮內膜組織TGF-β1mRNA相對表達量分別為2.26±0.96、1.02±0.38(t=7.908,P<0.05)。

2.2 各組細胞TGF-β1mRNA相對表達量比較 培養(yǎng)48 h時1、2組細胞TGF-β1mRNA相對表達量分別為8.88±1.03、1.00±0.02(P<0.05);培養(yǎng)48 h時3、4組細胞TGF-β1mRNA相對表達量分別為0.57±0.07、1.00±0.04(P<0.05)。

2.3 不同培養(yǎng)時間各組細胞OD值比較 培養(yǎng)0、24、48、72 h時各組細胞OD值比較見表1。

表1 培養(yǎng)0、24、48、72 h時各組細胞OD值比較

注：與2組比較，*P<0.05；與4組比較，#P<0.05。

2.4 各組細胞穿膜數(shù)比較 培養(yǎng)48 h時1、2組細胞穿膜數(shù)分別為73.98±10.32、50.67±8.94(P<0.05);培養(yǎng)48 h時3、4組細胞穿膜數(shù)分別為28.04±7.99、53.17±10.52(P<0.05)。結果見圖1。

圖1 培養(yǎng)48 h時各組細胞穿膜情況

2.5 各組細胞β-catenin、cMYC相對表達量比較 培養(yǎng)48 h時各組細胞β-catenin、cMYC相對表達量比較見表2。

表2 培養(yǎng)48 h時各組細胞β-catenin、cMYC相對表達量比較

注：與2組比較，*P<0.05；與4組比較，#P<0.05。

3 討論

EMs是一種常見的婦科慢性疾病，嚴重影響患者的生活質量，并導致患者不孕和具有惡性腫瘤高發(fā)高風險，是婦科疾病領域中的研究熱點[1]。ESCs可逃避正常的免疫監(jiān)視，侵襲遷移到子宮體以外的組織進行增殖，生成血管，形成異位的子宮內膜組織，目前EMs的發(fā)病機制尚未完全明確，其中包括逆行性月經、免疫功能紊亂、侵入性植入和子宮內膜組織的異位生長，月經逆行理論認為，月經期間子宮內膜組織的反流是異位子宮內膜的來源，是EMs發(fā)病機制中最為廣泛接受的假說[7]。在EMs疾病的初始階段，反流的子宮內膜組織與腹膜間皮的黏連附著是EMs病變形成的關鍵步驟，αvβ3、α4β1、VCAM-1和Nectin-4等黏附分子是促進子宮內膜與間皮組織附著黏附微環(huán)境的重要因素[8，9]，而大量研究[10]已經證實這些黏附分子受細胞生長因子的調節(jié)，但是這種調節(jié)的具體作用機制仍未明確，在EMs患者中已經報道了細胞生長因子在血清、腹膜液中的濃度顯著增加。細胞生長因子可能是促進ESCs增殖侵襲的關鍵因素，因此研究細胞因子在EMs發(fā)病過程中的作用及可能的機制對EMs的治療可能提供新的策略。

細胞生長因子是由細胞產生的傳遞細胞間信號的分子，參與組成細胞生長微環(huán)境，具有影響細胞的生長、細胞外基質的形成及血管生成等生理作用，在疾病的發(fā)生發(fā)展中也具有重要作用[11]，其中TGF-β家族是一種25 kDa的肽，做為重要的一類細胞生長因子受到學者的廣泛關注。TGF-β抑制上皮細胞的生長，但是在多種惡性腫瘤組織中高表達[12]。眾所周知腫瘤的惡性行為包括惡性增殖、高度侵襲和轉移，而EMs在發(fā)病過程中同樣具備侵襲增殖等惡性生物學行為，因此TGF-β可能促進EMs的發(fā)生發(fā)展。TGF-β包括三種亞型，不同亞型的表達模式與疾病進展的相關性不同，TGF-β1參與調控免疫監(jiān)視、細胞黏附和腹膜侵入或植入細胞的生長，研究[10]報道TGF-β1被認為是EMs發(fā)病機制中的關鍵參與者，TGF-β1在EMs患者中的血清、腹膜液和囊腫組織中的表達均高于未患有無EMs的健康對照女性，在TGF-β1存在時子宮內膜細胞與腹膜粘附性升高[4]。Yu等[6]采用qRT-PCR和Western-blot檢測40例EMs組織和40例正常對照子宮內膜組織中TGF-β1mRNA和蛋白的表達，結果顯示與正常對照子宮內膜組織相比，TGF-β1在mRNA和蛋白水平均高表達于EMs組織中，本研究對入住我院100例EMs患者異位的子宮內膜組織和40例未患有EMs患者的正常子宮內膜組織中TGF-β1的表達情況進行了檢測，qRT-PCR結果同樣顯示TGF-β1mRNA的表達水平在EMs患者異位的子宮內膜組織中的表達顯著高于正常子宮內膜組織，與已有的報道研究結果一致，而TGF-β1在EMs發(fā)病過程中的作用及機制需進一步研究。

首先我們從新鮮的異位子宮內膜組織分離培養(yǎng)出原代ESCs，并對其進行鑒定，vimentin表達于間質細胞而keratin表達于上皮細胞，因此利用免疫熒光發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)出的原代細胞中全部表達vimentin蛋白，而keratin蛋白幾乎不表達，表明原代ESCs成功分離出，可進行后續(xù)的功能實驗。在細胞培養(yǎng)基中加入TGF-β1因子可刺激細胞中TGF-β1的表達，本文采用2 ng/mL的TGF-β1因子處理ESCs，增加ESCs中TGF-β1表達后，MTS和Boyden實驗結果顯示ESCs增殖和侵襲能力增加。同時本文采用TGF-β1抑制劑Ly364947處理ESCs，抑制ESCs中TGF-β1的表達后，MTS和Boyden實驗結果顯示ESCs增殖和侵襲能力降低。以上結果表明TGF-β1促進ESCs的增殖和侵襲。李鳳梅等[13]報道TGF-β1通過誘導代謝重組促進EMs患者ESCs的遷移和侵襲。ESCs異位病灶微環(huán)境中的Treg細胞分泌的TGF-β1可能通過活化ERK和p38信號通路激活Smad2信號通路促進EMs的發(fā)生發(fā)展[14]。TGF-β1調控ESCs增殖和侵襲的作用機制仍需進一步探討，wnt/β-catenin通路是調控細胞增殖和侵襲轉移的重要信號通路之一，該通路與多種婦科腫瘤疾病的發(fā)病進展以及預后轉歸等關系密切[15,16]，張星光等[17]通過在組織水平驗證Wnt/β-catenin信號通路中相關蛋白在EMs異位子宮內膜組織中表達升高，得出Wnt/β-catenin信號通路影響EMs的遷移和侵襲，并且可能與術后疾病復發(fā)相關的結論。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路中的樞紐[18]，β-catenin的靶基因之一cMYC是原癌基因，在細胞增殖和侵襲過程中均發(fā)揮重要功能[19]。本研究采用Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)在ESCs中促進TGF-β1的表達，β-catenin和cMYC蛋白的表達增加，而在ESCs中促進TGF-β1的表達，β-catenin和cMYC蛋白的表達減少，表明TGF-β1可以激活Wnt/β-catenin信號通路，但是更具體的作用機制需后續(xù)深入的研究。

綜上所述，EMs患者異位子宮內膜組織TGF-β1mRNA表達升高。TGF-β1可能通過促進β-catenin、cMYC蛋白的表達，激活wnt/β-catenin信號通路，促進ESCs的增殖、侵襲。