朱崇文，戴林建，肖澤凡，鐘軍

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院煙草系，長沙市芙蓉區(qū)農(nóng)大路1號 410128

鉀是植物生長發(fā)育所必須的礦質(zhì)營養(yǎng)元素，參與植物體內(nèi)碳、氮代謝等多項(xiàng)生命活動[1]。煙草是典型的喜鉀作物，鉀也是煙草吸收最多的礦質(zhì)元素，充足的鉀含量是煙葉優(yōu)質(zhì)的前提之一[2]。并對提高煙葉的燃燒性，改善煙葉品質(zhì)，減少焦油產(chǎn)生具有重要作用[3]。

蛋白質(zhì)組學(xué)是以蛋白質(zhì)組為對象，研究蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后修飾的種類，蛋白與蛋白的相互作用等，從整體水平研究蛋白質(zhì)的組成和調(diào)控規(guī)律[4]。周利等利用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，對無菌培養(yǎng)四周的煙苗進(jìn)行低鉀處理，分別在低鉀處理12 h、24 h和48 h檢測到9種蛋白上調(diào)、10種蛋白上調(diào)和12種蛋白下調(diào)。其差異蛋白以光合作用相關(guān)蛋白質(zhì)和與應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)為最多[5]。

label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可基于一級譜圖母離子強(qiáng)度或肽段匹配的二級譜圖數(shù)目為基礎(chǔ)的蛋白定量分析方法[6]。理論上，label-free可用于任何樣本的蛋白質(zhì)定量分析，可對不同來源的同一樣本的定量數(shù)據(jù)進(jìn)行互相比較，且數(shù)據(jù)移植性高[4]，得到廣泛應(yīng)用。宋浩等通過label-free蛋白定量技術(shù)研究了煙草青枯病菌侵染煙草后，其蛋白質(zhì)應(yīng)答情況，在致病菌株和非致病菌株中分別鑒定出15個(gè)致病性菌株中特有和287個(gè)非致病性菌株中特有的蛋白。這些差異表達(dá)蛋白主要定位于細(xì)胞外或與糖代謝相關(guān)[7]。阮土娣等利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜和label-free定量技術(shù)，研究里氏木霉中磷酸化蛋白在阻遏條件、誘導(dǎo)條件和中性條件下的表達(dá)差異，分別在誘導(dǎo)對比阻遏條件、誘導(dǎo)對比中性條件、阻遏對比中性條件中發(fā)現(xiàn)差異蛋白90、61和90個(gè)。這些差異蛋白可以分為鋅指蛋白、ATP結(jié)合蛋白、具有N-乙?；D(zhuǎn)移酶活性的蛋白以及具有氧化還原酶活性的蛋白[8]。

本研究以烤煙高鉀品系為材料，通過控制營養(yǎng)液中鉀濃度建立低鉀模型，采用label-free蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)定量分析蛋白質(zhì)表達(dá)情況。生物信息學(xué)方法分析鑒定與煙草葉片低鉀相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，探究差異蛋白的定位、功能以及參與的通路途徑等，為煙草品種選育與栽培調(diào)控提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

烤煙高鉀品系HKDN-5為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)戴林建[9]等自主培育。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

試驗(yàn)設(shè)計(jì)詳見參考文獻(xiàn)10。

待煙苗生長到5-6片葉時(shí)，選取長勢正常的4-5株植株，取其葉片制成混合樣，每組取3個(gè)重復(fù)樣。同時(shí)用鋁箔紙包裝好，編號，裝入布袋，迅速投入液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蛋白質(zhì)制備及濃度測定

取適量冷凍保存的煙草鮮嫩葉片，采用苯酚法[11]提取煙葉蛋白質(zhì)，并用Bradford[12]法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定。

1.2.3 蛋白質(zhì)酶解、nano-HPLC-MS/MS分析及其生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析

蛋白質(zhì)酶解方法、HPLC-MS/MS分析方法及其生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析詳見參考文獻(xiàn)10。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE電泳結(jié)果

圖1為兩組葉片蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分離后考染圖，兩組的細(xì)胞總蛋白質(zhì)分布均勻，均無極高豐度的蛋白質(zhì)，符合色譜質(zhì)譜檢測對蛋白豐度的要求，兩者也具有相似的蛋白條帶。

圖1 葉片蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE electrophorogram of leaf proteins

2.2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)鑒定及統(tǒng)計(jì)

經(jīng)質(zhì)譜檢測和數(shù)據(jù)庫查詢，烤煙高鉀品系HKDN-5低鉀對比正常鉀組的苗期葉片蛋白質(zhì)Group為3511個(gè)，蛋白質(zhì)ID為11419個(gè)。在其中選取差異倍數(shù)為1.5以上，且有顯著性意義（P<0.05）的差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，可知低鉀脅迫下的差異表達(dá)蛋白總數(shù)有101個(gè)，其中下調(diào)的蛋白點(diǎn)有52個(gè)，上調(diào)的有49個(gè)（圖2）。

圖2 差異蛋白質(zhì)火山圖Fig.2 Volcano plot of differential proteins

由表1可知，上調(diào)蛋白主要集中在[1.5-2]差異倍數(shù)間，占上調(diào)蛋白總數(shù)的53.1%，下調(diào)蛋白同樣主要集中在[1.5-2]差異倍數(shù)間，占下調(diào)蛋白總數(shù)的59.6%?？偟膩碚f，差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要集中在[1.5-4]差異倍數(shù)間，占總差異蛋白質(zhì)的90.1%，差異倍數(shù)大于2的差異表達(dá)蛋白質(zhì)為44個(gè)，占差異表達(dá)蛋白質(zhì)總數(shù)的43.6%。

表1 差異蛋白質(zhì)統(tǒng)計(jì)表Tab.1 Statistics table of differential proteins

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的GO注釋

由GO注釋（表2）可知，差異蛋白質(zhì)主要定位在細(xì)胞組分、細(xì)胞器組分和膜結(jié)構(gòu)中，占差異蛋白總數(shù)的91%；具有參與水解酶活性、離子結(jié)合和轉(zhuǎn)移酶活性的差異蛋白質(zhì)數(shù)量最多，占差異蛋白總數(shù)的84%；差異蛋白參與細(xì)胞代謝、有機(jī)物代謝、單組織代謝、單組織細(xì)胞過程和基本代謝過程的數(shù)量最多，占差異蛋白總數(shù)的70%。

表2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)GO注釋表Tab.2 GO annotation table of differentially expressed proteins

2.3.2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KOG注釋

如圖3所示，該圖表示低鉀脅迫中具有不同功能的差異表達(dá)蛋白質(zhì)的數(shù)量統(tǒng)計(jì)，功能蛋白可分為17種，分別為A、C、E、G、H、I、J、M、O、P、Q、R、S、T、U、V和Z等。差異表達(dá)蛋白質(zhì)中數(shù)量最多的為G類相關(guān)蛋白，數(shù)量最少的為H、I、Q、T和V類蛋白（均只有一個(gè)）。其中上調(diào)蛋白數(shù)量最多的為G類蛋白，下調(diào)蛋白數(shù)量最多的為O類蛋白，具有H、I和V功能相關(guān)的只有上調(diào)蛋白，具有A、P、Q和T功能相關(guān)的只有下調(diào)蛋白。說明在低鉀脅迫下，關(guān)于碳水化合物運(yùn)輸和代謝相關(guān)的蛋白（G類）的上調(diào)表達(dá)在煙葉正常生長發(fā)育過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。

圖3 差異蛋白質(zhì)KOG分類圖Fig.3 KOG classification map of differential proteins

表3為具有KOG號且差異倍數(shù)≥2的差異蛋白質(zhì)鑒定表，由表可以更清楚地了解到蛋白質(zhì)的名稱及其具有的KOG功能，以及差異蛋白酶在煙葉生長發(fā)育過程中可能發(fā)揮的作用。據(jù)表3可知，有13個(gè)蛋白（7個(gè)上調(diào)，6個(gè)下調(diào)）參與到G、E、P和I等代謝相關(guān)途徑；有2個(gè)蛋白（均為下調(diào)）參與到A和J等遺傳信息處理相關(guān)過程；有9個(gè)蛋白（6個(gè)上調(diào)，3個(gè)下調(diào)）參與到M和O等細(xì)胞和環(huán)境信息處理相關(guān)過程；有6個(gè)蛋白（均為上調(diào)）參與到R和S等其他過程。

2.3.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG pathway分析

根據(jù)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG pathway分析可知，差異表達(dá)蛋白質(zhì)共參與51條通路途徑。其中包括24條代謝通路，占總通路途徑的47.1%；9條合成途徑通路，占總通路途徑的17.6%；3條降解途徑，占總通路的5.9%。差異蛋白質(zhì)參與具有顯著性差異的途徑主要有：抗壞血酸與醛酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、淀粉與蔗糖代謝、氨基糖與核苷酸糖代謝、甘油酯代謝、二羧酸代謝、谷胱甘肽代謝和氨基酸生物合成等相關(guān)通路。而這些通路途徑基本都與物質(zhì)代謝相關(guān)，說明與正常鉀組相比，低鉀脅迫下的差異蛋白主要參與物質(zhì)代謝途徑。

3 討論

植物在高鉀低鉀不同處理下，產(chǎn)生的差異蛋白及其參與的生物學(xué)途徑不盡相同。關(guān)于高鉀處理下烤煙苗期葉片差異蛋白的表達(dá)，本課題組已有論文發(fā)表（見2019年河南農(nóng)業(yè)科學(xué)第5期）；關(guān)于低鉀脅迫下烤煙苗期根系差異蛋白的表達(dá)，課題組也已有論文發(fā)表（見2019年中國煙草科學(xué)第1期）；本文只討論低鉀脅迫下烤煙苗期葉片差異蛋白的表達(dá)及其參與的生物學(xué)途徑。

3.1 與代謝相關(guān)的差異蛋白質(zhì)

有研究表明煙草[5,13]、棉花[14]、苧麻[15]等植物在經(jīng)過低鉀處理后，產(chǎn)生的差異蛋白中與代謝過程相關(guān)的主要包括氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶、ATP合成酶、已糖激酶、磷酸酶類等。

本試驗(yàn)鑒定中，同樣發(fā)現(xiàn)己糖激酶和肌醇單磷酸酶等發(fā)生上調(diào)差異表達(dá)，紫色酸性磷酸酶和絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶等發(fā)生下調(diào)差異表達(dá)。此外，還發(fā)現(xiàn)β-半乳糖苷酶和銅轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白等下調(diào)較為明顯。這兩類蛋白的差異表達(dá)可能與鉀處理時(shí)間或烤煙品系的特殊性相關(guān)。

己糖激酶在試驗(yàn)中上調(diào)明顯，該酶為淀粉與蔗糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，具有催化己糖磷酸化的作用，其催化反應(yīng)構(gòu)成植物和其它有機(jī)體代謝活動的重要調(diào)控步驟[16]。己糖激酶還參與植物的糖感受和糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[17]，同時(shí)該酶既可參與葡萄糖抑制光合作用和糖酵解相關(guān)基因的調(diào)控，還在光合組織中起調(diào)節(jié)光合作用、生長發(fā)育和衰老的調(diào)節(jié)酶的作用[18]。

研究表明，紫色酸性磷酸酶能夠在低磷脅迫下幫助植物體將不能吸收的有機(jī)磷轉(zhuǎn)換成無機(jī)磷，以緩解植物缺磷狀況[19]，而在低鉀中，該酶的下調(diào)表達(dá)，可能是因?yàn)樵谌扁洯h(huán)境下，與鉀離子吸收轉(zhuǎn)運(yùn)等方面關(guān)系不大的蛋白會下調(diào)表達(dá)，助于維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶普遍存在于真核生物中，在高等植物的一碳代謝和光呼吸中起著非常重要的作用[20]。此外，該酶是植物體的光呼吸作用中關(guān)鍵酶之一，植物體中缺乏絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶，則會由于不能發(fā)生產(chǎn)氧的光合作用，而導(dǎo)致植物體生長被嚴(yán)重延遲[21]。低鉀營養(yǎng)下，該酶的下調(diào)表達(dá)便是植物生長緩慢，植株矮小的原因之一。

β-半乳糖苷酶又名乳糖酶，是一種廣泛存在于動植物及微生物中的多功能酶。它不但能夠水解乳糖，還具有半乳糖苷轉(zhuǎn)移活性[22]。研究表明β-半乳糖苷酶的功能團(tuán)可能不利于植物體的生長發(fā)育，特別是葉片的生長，所以該酶發(fā)生下調(diào)表達(dá)。銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不僅參與銅的細(xì)胞攝取，而且在其它重金屬離子的攝取過程中也發(fā)揮重要作用[23]。它是一種定位于細(xì)胞膜的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，除了轉(zhuǎn)運(yùn)銅離子外，也可以轉(zhuǎn)運(yùn)其他金屬離子，只是能不能轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子還尚未可知，需要進(jìn)一步研究。

3.2 與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的差異蛋白質(zhì)

低鉀脅迫在分子水平上的響應(yīng)，與其他非生物刺激的響應(yīng)有相同之處，不同的逆境刺激響應(yīng)在分子水平的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中可能具有相同的調(diào)控方式和調(diào)控過程[24]。研究發(fā)現(xiàn)煙草[5,13]、棉花[14]、苧麻[15]等植物在低鉀脅迫下的差異蛋白中與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的主要包括超氧化物歧化酶、過氧化物還原酶、轉(zhuǎn)錄因子等。

在本研究鑒定中，主要為谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和膜聯(lián)蛋白等酶發(fā)生上調(diào)表達(dá)，50S核糖體蛋白、蛋白酶體亞基和蛋氨酸亞砜還原酶等酶發(fā)生下調(diào)表達(dá)。鑒定的差異蛋白存在不同，同樣可能與鉀處理的時(shí)間不同或與烤煙高鉀品系的特殊性相關(guān)，為烤煙高鉀品系的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究鑒定基礎(chǔ)。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的上調(diào)表達(dá)可作為植物應(yīng)對逆境壓力的標(biāo)志之一[25]，在植物初級和次級代謝、誘導(dǎo)脅迫和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要功能[26]。該酶在代謝和解毒方面發(fā)揮重要作用[27]，表現(xiàn)在使內(nèi)源性或外源性毒素失活從而發(fā)揮解毒的作用[28]。該酶也可以參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的運(yùn)輸和儲存、細(xì)胞信號通路的調(diào)節(jié)[29]等途徑，在植物抗逆境脅迫以及維持植物的新陳代謝等方面發(fā)揮著重要作用[30]。其上調(diào)表達(dá)可能與煙草為在緩解鉀缺失造成的外界環(huán)境壓力問題，介于該酶的作用，推測該酶可能與鉀離子的運(yùn)輸、儲存及鉀吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的信號傳遞等途徑有關(guān)。

蛋氨酸亞砜還原酶是目前唯一確定的蛋白質(zhì)蛋氨酸亞砜殘基特征性還原酶，能夠?qū)⒌鞍彼醽嗧窟€原為蛋氨酸，起到調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能、調(diào)控相關(guān)信號通路、修復(fù)氧化損傷蛋白、防止氧化應(yīng)激等作用[31]。雖然這些蛋白與植物體內(nèi)蛋白的生理方面息息相關(guān)，但是并沒有直接參與植物體生長發(fā)育或應(yīng)激反應(yīng)過程。

3.3 其他差異蛋白質(zhì)

除了與應(yīng)激和代謝相關(guān)的差異蛋白中，試驗(yàn)鑒定的主要有幾丁質(zhì)酶、羥酰基谷胱甘肽水解酶和D-甘油酸3-激酶等發(fā)生差異表達(dá)，且均為發(fā)生上調(diào)。幾丁質(zhì)酶是廣泛存在于微生物和植物體內(nèi)的一類蛋白質(zhì)，能水解真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)，從而抑制真菌的生長增殖，提高植物的抗真菌能力，是一類重要的病程相關(guān)蛋白[32]。該酶是植物重要的防衛(wèi)因子，在植物生長發(fā)育、抗逆和防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[33]。羥酰基谷胱甘肽水解酶參與節(jié)間伸長，與激素調(diào)節(jié)相關(guān)，可以通過與其他相關(guān)酶的交互作用，協(xié)調(diào)作用促進(jìn)莖的伸長[34]。該酶的上調(diào)表達(dá)，無疑是在低鉀這種逆境下，促進(jìn)植物體生長的方式之一。

在本試驗(yàn)鑒定的蛋白中，并沒有發(fā)現(xiàn)與鉀轉(zhuǎn)運(yùn)體或離子通道直接相關(guān)的蛋白，推測可能的原因有：煙葉苗期期間，此類蛋白的差異并不明顯；此類蛋白主要作用在根系中；與烤煙高鉀品系的特殊性相關(guān)。具體的原因有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對低鉀脅迫下烤煙苗期葉片差異表達(dá)蛋白分析鑒定，大部分差異表達(dá)蛋白定位在細(xì)胞組分、細(xì)胞器組分和膜結(jié)構(gòu)中，具有水解酶活性、離子結(jié)合和轉(zhuǎn)移酶活性等分子功能，參與細(xì)胞代謝、有機(jī)物代謝、單組織代謝、單組織細(xì)胞過程和基本代謝過程等生物過程。具有碳水化合物運(yùn)輸和代謝功能的差異表達(dá)蛋白數(shù)量最多，且主要參與物質(zhì)代謝相關(guān)途徑。大部分差異蛋白質(zhì)發(fā)生上調(diào)表達(dá)，為煙葉的抗逆生長等方面提供一定的保障。