張書春 ，代紫陽 ，王 亞 ，夏 娟 ，杜夢凡 ，姚 紋

（1.唐山南湖醫(yī)院，唐山 063000；2.華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，唐山 063210）

糖尿病是一種多病因引起的以高血糖為特征的內(nèi)分泌代謝性疾病。高血糖還可通過誘導(dǎo)、加重炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等機(jī)制在糖尿病諸多并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展過程中占重要地位。糖尿病性心肌病是一種常見的糖尿病心血管并發(fā)癥，是獨(dú)立于高血壓性心臟病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的心肌損害性疾病。研究顯示炎癥反應(yīng)在糖尿病心肌損害的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要的作用[1]。其中，在糖尿病心肌損傷相關(guān)動物、細(xì)胞模型中存在大量炎癥細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的分泌及炎癥相關(guān)信號分子如核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）等的過度激活，持續(xù)存在的炎癥反應(yīng)最終導(dǎo)致心肌損害的發(fā)生[2-4]。黃芪甲苷是中藥黃芪所含有的重要有效化學(xué)成分之一，具有明確的降糖、調(diào)脂作用[5]，且通過抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗細(xì)胞凋亡等機(jī)制對心血管系統(tǒng)具有廣泛的保護(hù)作用[6]。本研究旨在觀察黃芪甲苷對高糖誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并從 IκB 激酶（IKK）/NF-κB 炎癥相關(guān)通路探討其作用機(jī)制。

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞株 大鼠胚胎心臟組織來源的H9c2細(xì)胞株，購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥 黃芪甲苷購自遼寧生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 試劑 DMEM高糖、低糖培養(yǎng)基（GIBCO公司），胰蛋白酶（SIGMA公司），胎牛血清（GIBCO公司），噻唑藍(lán)（MTT）細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），TNF-α、IL-6（南京建成生物工程研究所），兔抗大鼠IKK-β、NF-κB、p-NF-κB（Ser536）、TNF-α（Cell Signaling 公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.4 儀器 37℃二氧化碳孵箱，上海易亮醫(yī)療器械有限公司；超凈工作臺，江蘇蘇州凈化設(shè)備公司；冷凍離心機(jī)，德國SIGMR Laborzentrifugen；酶標(biāo)儀，奧地利TECAN公司；JY200C電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；半干轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，BIO-RAD公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 37℃、5%CO2條件下孵育H9c2細(xì)胞，給予 10%FBSDMEM（低糖，5.5 mmol/L）培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞生長融合約覆蓋皿底面積80%時(shí)進(jìn)行傳代。無血清低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，使各組細(xì)胞生長同步化后再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞活性 細(xì)胞貼壁生長48 h，吸棄每孔原培養(yǎng)基，加入新培養(yǎng)基100μL，再加入MTT溶液10μL，置細(xì)胞于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h。每孔加入DMSO 150μL，于細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育細(xì)胞15 min，使用酶標(biāo)儀測定吸光度OD值（波長570 nm）。

2.3 高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型的建立 根據(jù)文獻(xiàn)研究[7]及預(yù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以高糖（33.3 mmol/L）培養(yǎng)基處理H9c2心肌細(xì)胞24 h建立心肌細(xì)胞損傷模型。

2.4 黃芪甲苷對細(xì)胞活力的影響 選擇對數(shù)生長期H9c2心肌細(xì)胞，胰酶消化后重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以2 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。黃芪甲苷（20、40、80μmol/L）預(yù)處理 6 h，再加入高糖培養(yǎng)基24 h，MTT法檢測細(xì)胞活性。

2.5 分組及處理 正常對照組：給予10%FBS低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；高糖對照組：給予10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；高糖+黃芪甲苷低劑量組：黃芪甲苷（20μmol/L）預(yù)處理6 h，再給予10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；高糖+黃芪甲苷中劑量組：黃芪甲苷（40μmol/L）預(yù)處理6 h，再給予10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；高糖+黃芪甲苷高劑量組：黃芪甲苷（80μmol/L）預(yù)處理6 h，再給予10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.6 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測 TNF-α和IL-6的含量待細(xì)胞生長融合約覆蓋皿底面積80%時(shí)，按照分組給予不同處理后，收集培養(yǎng)基作待測標(biāo)本，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定出細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6的含量水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.7 Western Blot檢測 IKK、NF-κB、p-NF-κB（Ser536）、TNF-α水平吸棄各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，加入IP細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，刮取細(xì)胞，離心 15 min（4℃，12 000 r/min）。BCA 法測定細(xì)胞蛋白濃度。制備分離膠（10%）和濃縮膠（5%）。上樣總蛋白100μg，加入電泳緩沖液，設(shè)定電泳電壓及時(shí)間（濃縮膠∶80 V，40 min；分離膠∶150 V，1 h）。再將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（52 mA，2 h）。5%脫脂奶粉封閉1 h， 加 入 相 應(yīng) 一 抗 （IKK、NF-κB、p-NF-κB（Ser536）、TNF-α、GAPDH），4℃過夜。洗膜后孵育HRP標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠第二抗體，室溫2 h。再次洗膜后，ECL顯色，暗室內(nèi)曝光。結(jié)果用Image J軟件分析，計(jì)算蛋白條帶灰度值，目的蛋白表達(dá)水平用目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值來表示。

2.8 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者選用LSD法，方差不齊者選用Dunnett’s T3法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度黃芪甲苷對各組細(xì)胞存活率的影響 與正常對照組相比，高糖對照組的細(xì)胞存活率明顯下降（P＜0.05）；與高糖對照組相比，高糖+黃芪甲苷（20、40、80μmol/L）各組的細(xì)胞存活率有所提高，且黃芪甲苷對細(xì)胞存活率的提高效果呈劑量依賴性。在黃芪甲苷藥物治療組中，高糖+黃芪甲苷高劑量組（80μmol/L）組的細(xì)胞存活率最高（P＜0.05）。見表1。

表1 不同處理因素對高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞存活率的影響（x±s）Tab.1 Effects of different treatment factors on the survival rate of myocardial cells induced by high glucose（x±s）

3.2 各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNF-α和IL-6的含量 與正常對照組相比，高糖對照組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α和IL-6的含量均明顯增加（P＜0.05）；與高糖對照組相比，高糖+黃芪甲苷（20、40、80 μmol/L）各組的TNF-α和IL-6在細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的含量均有所降低（P＜0.05），且降低效果呈黃芪甲苷劑量依賴性，以高糖+黃芪甲苷高劑量組（80μmol/L）下降最為顯著（P＜0.05）。見表 2。

表2 各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNF-α和IL-6的含量（x±s）Tab.2 Supernatant contents of TNF-αand IL-6 in each group（x±s）ng/L

3.3 黃芪甲苷對H9c2細(xì)胞IKK-β，NF-κB，p-NF-κB，TNF-α蛋白表達(dá)的影響 與正常對照組比較，高糖對照組H9c2細(xì)胞IKK-β蛋白表達(dá)增加顯著（P＜0.05），NF-κB 蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05），但NF-κB 磷酸化水平顯著增加（P＜0.05），TNF-α 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。黃芪甲苷各處理組H9c2細(xì)胞 IKK-β 蛋白表達(dá)下降（P＜0.05），NF-κB 磷酸化水平減弱（P＜0.05），TNF-α蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），且各指標(biāo)變化呈現(xiàn)黃芪甲苷劑量依賴性，以黃芪甲苷高劑量組改變最為明顯（P＜0.05）。見表 3、圖 1。

表3 黃芪甲苷對H9c2細(xì)胞IKK-β，NF-κB，p-NF-κB，TNF-α 蛋白表達(dá)的影響（x±s）Tab.3 Effect of astragaloside IV on protein expressions of IKK-β，NF-κB，p-NF-κB and TNF-α in H9c2 cells（x±s）%

圖1 黃芪甲苷對H9c2細(xì)胞IKK-β，NF-κB，p-NF-κB，TNF-α蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effect of astragaloside IV on protein expressions of IKK-β，NF-κB，p-NF-κB and TNF-α in H9c2 cells

4 討論

糖尿病性心肌病是一種發(fā)生于糖尿病患者的特異性心肌病變，可造成糖尿病患者心力衰竭，具有較高的死亡率。糖尿病以慢性高血糖為特征，高糖刺激與炎癥狀態(tài)密切相關(guān)[8]，而炎癥是糖尿病心肌損害的發(fā)生機(jī)制之一，亦有諸多研究表明抗炎可以有效減輕糖尿病心肌損害[9-10]。其中，TNF-α可引發(fā)炎癥和細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致心肌纖維化[11]。在糖尿病心肌病大鼠模型中，抑制TNF-α可以減少心肌纖維化，改善心臟功能[12]。本實(shí)驗(yàn)高糖孵育H9c2心肌細(xì)胞24 h建立細(xì)胞損傷模型，細(xì)胞活力明顯下降，細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的炎癥因子如TNF-α、IL-6水平明顯升高，細(xì)胞內(nèi)TNF-α的蛋白表達(dá)亦增高，提示高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。

NF-κB是廣泛存在于機(jī)體內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子，是介導(dǎo)炎癥因子釋放的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子[13]。當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，NF-κB與抑制性蛋白IκB以復(fù)合體的形式存在，處于未激活、無活性狀態(tài)；當(dāng)細(xì)胞受到多種因素刺激后，IκB激酶復(fù)合體（IKK）中的催化亞基IKK-β將IκB磷酸化并使之降解，從而NF-κB被磷酸化激活。磷酸活化的NF-κB轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與特定靶基因結(jié)合并調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，釋放IL-6、TNF-α等相關(guān)炎癥因子[14]。而TNF-α、IL-6等炎癥因子的釋放可反饋性作用于NF-κB，使之處于持續(xù)激活狀態(tài)，進(jìn)而持續(xù)的炎癥狀態(tài)造成心肌損傷[15]。本實(shí)驗(yàn)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型中IKK-β蛋白表達(dá)增加，NF-κB磷酸活化水平加強(qiáng)，提示IKK/NF-κB炎癥相關(guān)通路過度激活。

黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分之一，其降糖、治療糖尿病并發(fā)癥的藥理作用明確[16-17]。黃芪甲苷可增強(qiáng)心肌收縮力，改善心肌能量代謝，抑制心室肥厚、心肌纖維化及心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，降血壓，對心血管系統(tǒng)具有廣泛的保護(hù)作用[18-20]。然而糖尿病心肌損害的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜[21]，黃芪甲苷究竟是通過哪些路徑來保護(hù)心肌細(xì)胞避免其受高血糖損害還需進(jìn)一步探索。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予H9c2心肌細(xì)胞黃芪甲苷預(yù)處理6 h可以明顯增強(qiáng)高糖孵育條件下的心肌細(xì)胞活力，降低細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-6水平，減弱細(xì)胞內(nèi)TNF-α的蛋白表達(dá)，并明顯抑制過度激活的IKK/NF-κB炎癥相關(guān)通路。

綜上所述，高糖刺激誘導(dǎo)IKK/NF-κB炎癥通路的級聯(lián)反應(yīng)過度激活參與糖尿病心肌損傷的發(fā)生、發(fā)展過程。黃芪甲苷呈劑量依賴性對糖尿病心肌損害具有明顯的防治作用，各項(xiàng)異常指標(biāo)的改善情況以黃芪甲苷高劑量組（80μmol/L）最為顯著，其可能機(jī)制是與降低IKKβ的蛋白表達(dá)，下調(diào)NF-κB的磷酸活化水平，從而抑制了IKK/NF-κB炎癥通路的過度激活，繼而降低了TNF-α、IL-6相關(guān)炎癥因子水平有關(guān)。