張 丹，秦 偉，劉慧芳，王曉雪，陳文倩，張相林

(中日友好醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100029)

布洛芬作為非甾體抗炎藥，具有鎮(zhèn)痛、解熱和抗炎的作用。其作用機(jī)制為通過抑制環(huán)氧酶活性，減少前列腺素合成，從而減輕前列腺素引起的組織充血、腫脹，降低周圍神經(jīng)痛覺的敏感性。此外，布洛芬還可通過作用于下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞而發(fā)揮解熱作用。目前，布洛芬混懸液是臨床上治療患兒急性發(fā)熱的首選藥物，同時(shí)用于毛細(xì)支氣管炎或呼吸道感染后的喘息[1]及兒童外傷性疼痛[2-4]等。雖然布洛芬調(diào)節(jié)體溫、鎮(zhèn)痛的療效明確，但臨床研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)其不良反應(yīng)發(fā)生率較高，除常見的胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制等不良反應(yīng)外，還可導(dǎo)致過敏性肝損傷[5]，并有低溫癥及急性腸胃炎導(dǎo)致脫水的患兒使用布洛芬后引發(fā)急性腎損傷的報(bào)道[6-8]。因此，檢測布洛芬的血藥濃度顯得尤為重要。由于兒童患者的服藥劑量較小，患兒體內(nèi)藥物暴露量較低，已報(bào)道的檢測方法無法滿足患兒體內(nèi)布洛芬的血藥濃度檢測，且操作繁瑣，時(shí)效性較差[9-10]。因此，本研究旨在建立一套快速、靈敏、簡便、準(zhǔn)確且穩(wěn)定的超高效液相色譜檢測方法，以檢測兒童患者血漿中布洛芬的含量，以保證布洛芬用于兒童患者的有效性和安全性。

1 材料

1.1 儀器

超高效液相色譜儀(日本島津公司)，包括LC-20AD泵、DGU-12AS在線脫氣機(jī)、SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20 A柱溫箱、CBM-20 A系統(tǒng)控制器、SPD-M20 A 檢測器及LabSolutians色譜工作站；JingLi LDZ5-2低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；Sigma 3K15超高速離心機(jī)(美國Sigma公司)；CPA225D萬分之一電子分析天平(德國 Sartorius公司)；Vortex Genie 2多用途旋渦混合器(美國Scientific Industries公司)；Milli-Q Advantage A10純水機(jī)(法國Millipore公司)。

1.2 藥品與試劑

布洛芬對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100179-201105，純度>99.5%)，萘普生對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100198-200403，純度>99.5%)；甲醇為色譜純(美國Fisher公司)；H3PO4為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為Millipore超純水；空白血漿由中日友好醫(yī)院(以下簡稱“我院”)檢驗(yàn)科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為0.1%H3PO4(pH=2.1)-甲醇(V∶V=30∶70)；布洛芬檢測波長為220 nm，內(nèi)標(biāo)化合物萘普生檢測波長為270 nm，流速為1.0 ml/min；柱溫為35 ℃。布洛芬、萘普生的出峰時(shí)間分別為14.88、6.8 min。

2.2 布洛芬血漿樣品的處理

準(zhǔn)確吸取血漿樣品190 μl于離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液10 μl，甲醇溶液600 μl，渦旋混勻3 min，12 000 r/min下離心5 min，取上清液10 μl進(jìn)樣檢測。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液及內(nèi)標(biāo)溶液的制備

精密稱取布洛芬對照品30.0 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成3 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分裝并于-80 ℃凍存?zhèn)溆?。精密稱取萘普生對照品45.0 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成4.5 mg/ml的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，分裝并于-20 ℃凍存?zhèn)溆?。臨用前，取內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液100 μl，加甲醇900 μl，渦旋混勻，即得0.45 mg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 專屬性驗(yàn)證：考查空白血漿中布洛芬和內(nèi)標(biāo)化合物的方法專屬性。結(jié)果表明，布洛芬與內(nèi)標(biāo)基線分離且峰形良好，空白血漿中未見明顯干擾，見圖1。

A1、A2：空白血漿；B1、B2：空白血漿加標(biāo)準(zhǔn)品；C1、C2：患兒樣本A1,A2: blank plasma; B1,B2: blank plasma and standard product; C1,C2: Samples圖1 布洛芬專屬性檢測Fig 1 Exclusive detection of ibuprofen

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取空白血漿180 μl，分別加入不同濃度的布洛芬對照品溶液10 μl，使布洛芬質(zhì)量濃度分別為1、1.5、10、15、100及150 μg/ml，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，進(jìn)樣分析。以樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)，布洛芬質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，布洛芬質(zhì)量濃度在1～150 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為：Y=0.241 4X+0.002 3，r=0.999 9。定量限為1 μg/ml，符合生物樣本檢測的定量要求。

2.4.3 提取回收率試驗(yàn)：配制低、中及高3個(gè)質(zhì)量濃度的布洛芬標(biāo)準(zhǔn)溶液(3、10及30 μg/ml)并測定，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)5份，以樣品或內(nèi)標(biāo)提取后的峰面積與樣品或內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)液的峰面積比值計(jì)算布洛芬的絕對回收率，見表1。

表1 布洛芬的提取回收率Tab 1 Recovery rate of ibuprofen

2.4.4 精密度和方法回收率試驗(yàn)：取布洛芬低、中及高3個(gè)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)5份，依照“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，進(jìn)樣分析后計(jì)算日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果見表2。

表2 布洛芬方法日內(nèi)日間精密度及方法回收率Tab 2 Precision and method recovery in intraday and interday determination of ibuprofen

2.4.5 穩(wěn)定性考察：取布洛芬低、中及高3個(gè)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)5份，分別考查其在室溫(25 ℃)條件下放置6 h的穩(wěn)定性；考查標(biāo)準(zhǔn)溶液按“1.7”項(xiàng)下方法處理后，樣本放置24 h的穩(wěn)定性；考查標(biāo)準(zhǔn)溶液-20 ℃反復(fù)3次凍融后穩(wěn)定性，進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，該布洛芬該檢測方法穩(wěn)定、樣本凍融穩(wěn)定性良好，可滿足生物樣本中布洛芬的定量分析，見表3。

表3 穩(wěn)定性考察結(jié)果Tab 3 Stability of ibuprofen

2.5 患者血藥濃度測定

收集我院兒科10例進(jìn)行布洛芬血藥濃度監(jiān)測患兒的血液樣本，患兒經(jīng)臨床診斷為川崎病并口服布洛芬混懸液，每6 h服藥1次，服用4次后，于第5次給藥前取血，給藥劑量、患兒信息及經(jīng)上述方法檢測的布洛芬血漿藥物濃度見表4。結(jié)果顯示，10例患兒布洛芬血漿藥物濃度在1.16～13.88 μg/ml之間，大部分患兒維持在1～2 μg/ml。

表4 10例川崎病患兒布洛芬血漿藥物濃度測定結(jié)果Tab 4 Determination of serum ibuprofen concentration in 10 cases of children with Kawasaki disease

3 討論

布洛芬用于解熱鎮(zhèn)痛抗炎已被廣大患者和醫(yī)務(wù)人員所接受。其作用機(jī)制明確，療效明顯，不良反應(yīng)小，成為了臨床兒科解熱鎮(zhèn)痛的主要用藥。前期研究中，對于布洛芬的濃度定量檢測方法較多關(guān)注于原料藥或制劑[11]，主要采用高效液相色譜的檢測方法，方法的定量限在5～10 μg/ml左右[12-14]。布洛芬的藥物濃度定量檢測方法主要采用氣相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，方法的定量限在1.5 μg/ml左右[15-17]。血清中布洛芬藥物濃度檢測的樣品處理過程復(fù)雜，操作繁瑣，且主要應(yīng)用于成人血清中藥物濃度的檢測。

本研究建立了基于超高效液相色譜法分析兒童患者體內(nèi)布洛芬血藥濃度的方法，前處理方法采用甲醇直接沉淀蛋白法，所需血漿樣品量小，混勻后可直接取上清液進(jìn)行分析測定，該提取方法操作簡便且回收率高。由于兒童服用布洛芬的劑量較低，因此本方法的最低定量限為1 μg/ml，在1～150 μg/ml的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 9)，方法提取回收率約80%，日間和日內(nèi)變異<5%，符合生物樣本分析要求，能夠滿足兒童患者體內(nèi)藥物濃度的檢測要求；且不受內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，但有部分患兒存在合并外源性藥物干擾的情況。本方法采用超高效液相色譜法和紫外檢測器測定布洛芬的血藥濃度，具有廣泛的適用性。儀器分析周期為15 min左右，具有較高的分析速度和效率。本研究共收集了10份川崎病患兒服用布洛芬后的血漿樣本進(jìn)行藥物濃度監(jiān)測，患兒均規(guī)律服用布洛芬進(jìn)行退熱治療，大部分患兒的血漿藥物濃度保持在1～2 μg/ml之間，反映了患兒服用布洛芬后藥物谷濃度的情況，對布洛芬在兒童患者血漿中藥物濃度的測定提供了一定的數(shù)據(jù)參考。