李 洋，閆保君

腦梗死是最常見的腦卒中類型(約占80%)，具有高病死率、高致殘率、高復發(fā)率的特點。已有研究顯示，哺乳動物大腦室管膜下區(qū)(subventricular zone,SVZ)的神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)在生理情況下處于相對靜息狀態(tài)，但在腦梗死后被激活，不斷增殖分化為新生神經(jīng)元，遷移至梗死灶附近，分化為成熟神經(jīng)元修復受損腦組織[1]，提示SVZ神經(jīng)發(fā)生或許是治療腦梗死的關(guān)鍵靶點。

促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)可促進腦梗死后神經(jīng)功能恢復，但其存在增高血液黏滯度，誘發(fā)血栓等副作用。氨甲酰促紅細胞生成素 (carbamylated erythropoietin,CEPO)是無生血功能的EPO衍生物，無誘發(fā)血栓生成等副作用，且具有和EPO相近的神經(jīng)保護作用。已有文獻證實，CEPO可促進腦梗死后SVZ內(nèi)NSCs增殖[2]，但具體機制尚不明確。Akt/mTOR信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，與神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞增殖及突觸可塑性的調(diào)控密切相關(guān)。腫瘤學研究表明，CEPO與其受體結(jié)合后激活Akt/mTOR信號通路，促進結(jié)腸癌細胞增殖[3]。

本研究擬探討Akt/mTOR信號通路在CEPO促進腦梗死后神經(jīng)發(fā)生作用的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 CEPO(Warren Pharmaceuticals，美國)；GSK2141795(Aktx阻斷劑，MCE，美國)；5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU,Sigma-Aldrich，美國)；小鼠抗小鼠nestin抗體 (abcam,美國)；兔抗小鼠BrdU抗體(abcam，美國)；兔抗小鼠p-Akt抗體(abcam，美國)；兔抗小鼠p-mTOR抗體(abcam，美國)； Alexa Fluor?488標記的山羊抗小鼠二抗(abcam，美國)；Alexa Fluor?555標記的驢抗兔二抗(abcam，美國)；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(proteintech，美國)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(proteintech，美國)。

1.2 實驗動物 成年雄性C57BL/6小鼠85只，體重25～30 g，12～14 w齡。根據(jù)完全隨機數(shù)字表法分為4組：Sham組(18只)、大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)組(23只)、CEPO組(20只)和GSK組(24只)。自模型成功后，CEPO組和GSK組小鼠每天接受CEPO腹腔注射一次，劑量為8000 IU/kg，連續(xù)7 d；將GSK2141795溶于DMSO，再用生理鹽水稀釋，劑量為10 μg/g，GSK組小鼠自模型成功后隔天接受灌胃一次，連續(xù)7 d[4]。給予Sham組和MCAO組等量生理鹽水。在避光條件下，將BrdU粉末溶于生理鹽水，濃度為5 mg/ml。用于免疫熒光的小鼠于術(shù)后1 d開始，連續(xù)7 d腹腔注射劑量為50 mg/(kg·d)的BrdU溶液[5]。

1.3 MCAO模型的制備 應用改良線栓法制作小鼠右側(cè)MCAO模型。術(shù)前禁食禁水12 h，用5%水合氯醛(7.0 ml/kg)腹腔注射麻醉后，取仰臥位固定。小鼠頸部備皮、消毒后，取正中切口，分離右側(cè)頸總、頸外及頸內(nèi)動脈。在距頸總動脈分叉約2 mm處剪一小口，插入線栓至大腦中動脈起始端，輕柔推進8～10 mm，結(jié)扎縫合。栓塞1 h后，緩慢拔出線栓約10 mm，剪去體外線栓。MCAO組、CEPO組和GSK組小鼠均按上述方法制作MCAO模型。Sham組小鼠將線栓插入至大腦中動脈起始端后迅速拔出，其余操作同以上3組。

1.4 神經(jīng)功能評定 參照改良神經(jīng)功能評分法(modified Neurological Severity Scores,mNSS)[6]，分別在小鼠造模后第1、7、14、28天進行神經(jīng)功能評價。從運動、感覺、平衡、反射4個方面對神經(jīng)功能進行綜合評估，評分12～16分的小鼠進入實驗。評分越高神經(jīng)功能損害越嚴重，0分，無神經(jīng)損傷癥狀；1分，有神經(jīng)功能損害；2分，神經(jīng)功能損害最嚴重。

1.5 免疫熒光 每組隨機抽取6只小鼠，取腦組織進行免疫熒光檢測。把BrdU作為細胞增殖標記物，nestin作為神經(jīng)干細胞標記物。用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)和4%多聚甲醛溶液灌注、固定各組小鼠，取腦后將其放入4%多聚甲醛溶液中過夜固定。然后分別置于10%、30%蔗糖溶液脫水至腦組織沉底。冰凍后切成20 μm厚的腦片，PBS中漂洗后，放入0.25%Triton X-100溶液打孔30 min。1%BSA溶液封閉30 min后，4 ℃孵育一抗過夜：兔抗小鼠BrdU抗體(1∶600)，小鼠抗小鼠nestin抗體(1∶200)。PBS漂洗腦片3×10 min后，在室溫下孵育555標記的驢抗兔二抗(1∶400)和488標記的山羊抗小鼠二抗(1∶400)1 h，再用PBS漂洗，在400倍熒光顯微鏡下觀察、拍照[7]。分別隨機選取SVZ 3個不重疊視野，每只小鼠至少選擇3張腦片。應用Image J(NIH)圖像分析軟件計算每組SVZ增殖NSCs數(shù)。

1.6 Western blot 每組隨機抽取6只小鼠，在第7天用Western blot技術(shù)檢測各組小鼠SVZ中p-Akt和p-mTOR的表達量。取小鼠梗死側(cè)SVZ組織，加入適量RIPA、PMSF和磷酸酶抑制劑。將組織置于冰上充分勻漿后離心15 min(4 ℃，14000 r/min)，取上清液測定總蛋白含量，分裝保存于-80 ℃。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。室溫下用5%BSA溶液封閉1 h后，加入兔抗小鼠p-Akt一抗(1∶600)，在4 ℃下孵育過夜。用TBST漂洗3×5 min，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h。洗滌5 min，把PVDF膜放入掃描儀內(nèi)，采用ECL顯色，觀察、拍照，用Image J分析所獲取條帶灰度。甘油酸-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和p-mTOR一抗(1∶800)檢測步驟同上[8]。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能評分 重復測量方差分析結(jié)果顯示，CEPO組小鼠mNSS分值整體下降情況明顯低于MCAO組和GSK組(P<0.05)；MCAO組和GSK組小鼠mNSS整體下降情況，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。單因素方差分析比較各組各個時間點差異(見表1)。

2.2 CEPO顯著促進小鼠SVZ內(nèi)NSCs增殖 免疫熒光結(jié)果顯示，術(shù)后7 d，MCAO組小鼠SVZ中BrdU+/Nestin+細胞數(shù)較Sham組顯著增多，且CEPO組BrdU+/Nestin+細胞數(shù)較MCAO組和GSK組明顯增多，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖1、表2)。

2.3 CEPO通過激活Akt/mTOR信號通路促進SVZ中NSCs增殖 術(shù)后7 d，MCAO組p-Akt和p-mTOR表達量較Sham組明顯增加，CEPO組的表達量較MCAO組明顯增加，GSK組的表達量較CEPO組顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖2、表3)。

表1 各組小鼠mNSS差異(分,

與CEPO組比較*P<0.05；Sham組小鼠mNSS評分為0

表2 各組小鼠SVZ中BrdU+/Nestin+細胞(個,

與Sham組比較*P<0.05；與CEPO組比較#P<0.05

表3 各組小鼠SVZ中各蛋白光密度

與Sham組比較*P<0.05；與CEPO組比較#P<0.05

圖1 各組小鼠SVZ中BrdU+/Nestin+細胞(免疫熒光，×400)

圖2 各組小鼠SVZ中p-Akt和p-mTOR表達量

3 討 論

國內(nèi)外研究證實，腦梗死后SVZ神經(jīng)發(fā)生處于激活狀態(tài)，促進神經(jīng)發(fā)生可改善腦梗死病情，人為抑制神經(jīng)發(fā)生會加劇神經(jīng)功能損傷[9]。成年哺乳動物腦SVZ內(nèi)神經(jīng)發(fā)生持續(xù)終生，在腦部創(chuàng)傷、脊髓損傷、腦組織缺血、腦出血等病理條件下，SVZ神經(jīng)發(fā)生激活，能夠自我更新、存在高度分化潛能的內(nèi)源性NSCs生成大量的新生神經(jīng)元，后者沿血管網(wǎng)定向遷移至梗死區(qū)，通過參與免疫調(diào)節(jié)、局部血管新生并分化為成熟神經(jīng)元替代或修復神經(jīng)損傷。

EPO通過與造血相關(guān)組織中EPO受體(EPOR)結(jié)合刺激紅細胞增殖、分化與成熟。近來研究表明，EPOR在許多細胞中均有表達，包括神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞和血管內(nèi)皮細胞，EPO可通過促進血管發(fā)生、抑制炎癥反應、抑制NO的合成、阻斷谷氨酸興奮毒性、抗氧化反應和細胞凋亡、增強神經(jīng)突觸信號傳遞、調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞的增殖與分化等途徑在缺血性腦血管疾病中發(fā)揮重要保護作用，改善腦梗死后神經(jīng)功能預后[10]。盡管如此，由于EPO促進紅細胞生成，存在易導致紅細胞增多癥，增高血液黏滯度，改變血流動力學而誘發(fā)形成血栓等副作用，從而限制了EPO在腦梗死等疾病的臨床運用。EPO中的賴氨酸通過氨甲?；磻D(zhuǎn)換為高瓜氨酸而形成CEPO，后者是無生血功能的EPO衍生物，不與經(jīng)典的EPOR結(jié)合，不刺激骨髓造血系統(tǒng)，無促紅細胞生成和誘發(fā)血栓等副作用，且具有和EPO相近的神經(jīng)保護作用。CEPO作為一種神經(jīng)保護劑，可促進腦梗死后SVZ內(nèi)NSCs增殖，但其具體機制尚不明確。

Akt/mTOR是公認的細胞內(nèi)經(jīng)典信號途徑，參與細胞增殖、分化及凋亡等多種功能的調(diào)節(jié)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Akt/mTOR信號通路與神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞的增殖分化、突觸的重塑、神經(jīng)遞質(zhì)的信號傳遞、氧化應激以及自噬、凋亡的調(diào)控密切相關(guān)，在神經(jīng)生理病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。Akt/mTOR信號通路在受到外部刺激因素后被激活，Akt活化后，mTOR隨之被激活，通過調(diào)節(jié)其下游的p70S6K和4EBP1管理基因編碼和蛋白合成介導神經(jīng)細胞增殖、發(fā)育分化、軸突再生、髓鞘形成以及突觸重塑。本研究結(jié)果表明，腦梗死后上調(diào)了SVZ內(nèi)Akt信號通路，mTOR表達量升高，SVZ神經(jīng)發(fā)生比正常生理狀態(tài)有所增強。使用CEPO后SVZ中Akt和mTOR表達量進一步升高，NSCs增殖增強，促進腦梗死后神經(jīng)功能恢復。而應用Akt選擇性阻斷劑GSK2141795，抑制了Akt表達，并伴隨有mTOR表達量的下降，抵消了CEPO對腦梗死的神經(jīng)功能恢復作用。證明了腦梗死后CEPO可能通過Akt/mTOR信號通路，產(chǎn)生促進SVZ內(nèi)NSCs增殖的效應，進而改善神經(jīng)功能。本研究探索了CEPO對腦梗死后SVZ內(nèi)NSCs增殖的具體機制，為找到促進腦梗死后神經(jīng)發(fā)生的潛在靶點提供了重要依據(jù)。