董 梅，史肖鶴，王 煒，李世平，侯慧清，吳冰潔

視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病(Neuromyelitis optica spectrum disorders，NMOSD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system，CNS)炎性免疫性疾病，反復(fù)發(fā)作，主要為視神經(jīng)炎、長節(jié)段橫貫性脊髓炎和顱內(nèi)典型部位[1]，中國、日本等亞洲地區(qū)患病顯著高于歐美等國家[2,3]。常導(dǎo)致失明、截癱等，是我國青壯年致殘的重要原因之一。因此，探索其發(fā)病機(jī)制，尋找潛在的治療靶點(diǎn)尤為關(guān)鍵。

水通道蛋白4(Aquaporin 4,AQP4)抗體(AQP4-Ab)是NMOSD特異性抗體，在NMOSD發(fā)病機(jī)制中占據(jù)重要作用[4]。2015年修訂診斷標(biāo)準(zhǔn)將NMOSD分為AQP4抗體陽性和陰性兩類，AQP4抗體陰性 NMOSD可能包含其他異質(zhì)性致病因素[5]。AQP4-Ab與血腦屏障(Blood brain barrier,BBB)的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突成分 AQP4特異性結(jié)合，在補(bǔ)體參與下，導(dǎo)致嚴(yán)重的星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte,AS)損害，使AQP4和其標(biāo)志性成分膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)大量丟失，形成NMOSD根本性病理損害-星形膠質(zhì)細(xì)胞病(Astrocytopathy)[6]。上述證據(jù)表明：B細(xì)胞是NMOSD發(fā)病機(jī)制中重要參與者。作為AS重要組成成分，血清GFAP含量變化可以間接反應(yīng)腦組織損傷程度。

B細(xì)胞除產(chǎn)生特異性抗體外，還有多種“抗體非依賴性(Antibody Independent) ”功能，例如，新近發(fā)現(xiàn)部分B細(xì)胞亞群具有免疫調(diào)節(jié)作用，稱為“調(diào)節(jié)性B細(xì)胞”(Regulatory B cell,Breg)，主要通過分泌IL-10、TGF-β發(fā)揮免疫抑制作用，大量研究表明Breg在NMOSD急性期起重要作用。

本研究主要測(cè)定AQP4-Ab陽性的急性期NMOSD患者及健康對(duì)照組人群外周血CD19+CD24highCD38highBreg數(shù)量，以及血清IL-10、TGF-β的mRNA含量水平，進(jìn)一步探討B(tài)reg在NMOSD急性期的數(shù)量變化及功能，以及與EDSS評(píng)分之間的關(guān)系；通過對(duì)外周血GFAP測(cè)定及EDSS評(píng)分，探討GFAP是否與疾病殘疾程度有關(guān)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年12月-2017年12月就診于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院東院區(qū)神經(jīng)內(nèi)科的27例急性期NMOSD患者為實(shí)驗(yàn)組(急性期：患者出現(xiàn)新的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀體征，持續(xù)時(shí)間大于24 h不緩解，EDSS評(píng)分增加≥1分)，同期選取性別、年齡相似的20位健康志愿者作為對(duì)照組。所有患者均經(jīng)由我科主治及以上資質(zhì)的醫(yī)師診斷，符合最新NMOSD指南制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)研究征得患者或家屬同意，所有患者均在治療前抽取外周血。

1.2 標(biāo)本采集 患者急性期入院后，抽取晨起空腹靜脈血兩管，各2 ml，分別置于檸檬酸鈉管、EDTA管中，檸檬酸鈉管內(nèi)血于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。EDTA管靜脈血立即送血液科實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行CD19+CD24highCD38highBreg檢測(cè)，檸檬酸鈉管標(biāo)本冷存于-80 ℃，用于檢測(cè)IL-10、TGF-β、GFAP的mRNA水平。

1.3 研究方法

1.3.1 臨床資料收集 記錄所有研究對(duì)象的基本信息，包括：姓名、性別、年齡、病程、EDSS評(píng)分、AQP4抗體結(jié)果等。

1.3.2 應(yīng)用SYBR GreenⅠReal-time PCR方法檢測(cè)血液中IL-10、TGF-β及GFAP的 mRNA含量，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.3.2.1 Real Time PCR檢測(cè)目的基因引物均在北京Invitrogen公司合成。

1.3.2.2 提取樣本總RNA：采用Trizol法提取樣本總RNA，使用NanoDrop?ND-2000分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。

1.3.2.3 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser方法進(jìn)行，步驟一，去除基因組DNA反應(yīng)：于冰上配制反應(yīng)混合液，5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μl，gDNA Eraser1.0 μl，Total RNA 1 μg，加RNase Free H2O至總體積10 μl，42 ℃孵育2 min。步驟二，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，上述反應(yīng)液加入PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ 1.0 μl，RT Primer Mix 1.0 μl，5×PrimeScript Buffer 2 4.0 μl，RNase Free H2O 4.0 μl，共20 μl，37 ℃孵育15 min，之后放入85 ℃ 5 s，cDNA保存至-20 ℃冰箱備用。

1.3.2.4 Real Time PCR樣本檢測(cè) 將所有cDNA樣品分別配置RT-PCR反應(yīng)體系。體系配置如下：2 × Master Mix 10 μl，10 μmol的PCR特異引物F 0.5 μl，10 μmol的PCR特異引物R 0.5 μl，加水至總體積為18 μl 5000 rpm短暫離心。將18 μl 混合液、2 μl cDNA依次加入96-PCR板對(duì)應(yīng)的每個(gè)孔中，混勻，置于Real time PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，95 ℃，30 s；40個(gè)PCR循環(huán)95 ℃，5 s；60 ℃，40 s(收集熒光)。建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，從60 ℃緩慢加熱到99 ℃。將目的基因和內(nèi)參分別進(jìn)行Real time PCR反應(yīng)，每個(gè)樣本進(jìn)行3個(gè)復(fù)孔檢測(cè)。儀器自動(dòng)匯總熒光值后進(jìn)行分析。

1.3.3 血清CD19+CD24highCD38highBreg水平測(cè)定 患者EDTA管靜脈血送至河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室采用流式細(xì)胞學(xué)方法測(cè)定血清CD19+CD24highCD38highBreg水平。

2 結(jié) 果

2.1 研究對(duì)象的一般資料 NMOSD患者共27例，女性20例，平均發(fā)病年齡44歲(19～62歲)，患者均符合NMOSD診斷標(biāo)準(zhǔn)，平均EDSS評(píng)分3.59分，NMO-IgG陽性率75%。對(duì)照組20例，均為女性，平均發(fā)病年齡，41歲(20～64歲)，兩組性別、年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.2 NMOSD急性期患者與健康對(duì)照組CD19+CD24highCD38highBreg相比下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Breg水平與EDSS評(píng)分不存在線性相關(guān)關(guān)系(見圖1、圖2)。

2.3 NMOSD急性期患者與健康對(duì)照組血清IL-10、TGF-β的mRNA水平相比下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖3、圖4)。

2.4 NMOSD急性期患者與健康對(duì)照組血清GFAP水平相比升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GFAP與EDSS評(píng)分之間無線性相關(guān)關(guān)系(見圖5、圖6)。

圖1 NMOSD急性期患者為實(shí)驗(yàn)組，健康者為對(duì)照組，兩組血液中CD19+CD24highCD38highBreg數(shù)量比較實(shí)驗(yàn)組明顯降低P<0.05

圖2 血液中CD19+CD24highCD38highBregs數(shù)量與EDSS評(píng)分無相關(guān)關(guān)系

圖3 NMOSD急性期患者為實(shí)驗(yàn)組，健康者為對(duì)照組,兩組血液中IL-10 mRNA水平比較實(shí)驗(yàn)組明顯降低P<0.05

圖4 NMOSD急性期患者為實(shí)驗(yàn)組，健康者為對(duì)照組,兩組血液中TGF-β mRNA水平比較實(shí)驗(yàn)組明顯降低P<0.05

圖5 NMOSD急性期患者為實(shí)驗(yàn)組，健康者為對(duì)照組，兩組血液中GFAP mRNA水平比較實(shí)驗(yàn)組明顯升高P<0.05

圖6 血液中GFAP含量與EDSS評(píng)分無相關(guān)關(guān)系

3 討 論

B細(xì)胞是NMOSD發(fā)病重要因素，B細(xì)胞一個(gè)重要特征是激活后產(chǎn)生抗體。 其活化后大量增殖并分化為效應(yīng)B細(xì)胞亞群(漿細(xì)胞)和記憶B細(xì)胞亞群(Memory B cell,Bmem)，漿細(xì)胞能分泌特異性抗體，中和抗原執(zhí)行免疫保護(hù)功能，也可因攻擊具有免疫原性的自體組織導(dǎo)致自身免疫性疾病發(fā)生[7]。Bmem則在再次受刺激后， 直接增殖、分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生大量抗體。此外，B細(xì)胞還有多種“抗體非依賴性”功能，包括抗原呈遞、分泌各種細(xì)胞因子和趨化因子等。新近發(fā)現(xiàn)部分B細(xì)胞亞群具有免疫調(diào)節(jié)作用。Mizoguchi等[8]首次將具有免疫抑制特性的B細(xì)胞亞群定義為“調(diào)節(jié)性B細(xì)胞”(Breg)。大量研究提示Breg參與了自身免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤等眾多疾病的發(fā)病過程，Breg可抑制炎癥反應(yīng)細(xì)胞如DC細(xì)胞、T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，同時(shí)可促進(jìn)Treg細(xì)胞的抑制炎癥反應(yīng)作用，并誘導(dǎo)Treg活化[9]。

目前發(fā)現(xiàn)，CD19+CD24highCD38highB 細(xì)胞、CD19+CD24+CD27+B細(xì)胞和CD19+CD1d CD5+B細(xì)胞是人類Breg的3種表型[10]。主要通過分泌IL-10、TGF-β、IL-35發(fā)揮免疫抑制作用，其中IL-10被認(rèn)為是鑒定Breg的特征性標(biāo)志[11]。其中，CD19+CD24highCD38highBreg于2010年由英國倫敦大學(xué)學(xué)院Blair等[12]證實(shí)，隨后研究證實(shí)該表型Breg在多種自身免疫相關(guān)性疾病的患者外周血中數(shù)量降低且功能受損，表現(xiàn)為抑制性細(xì)胞因子IL-10分泌減少，從而抑制Th1細(xì)胞因子和誘導(dǎo)Th2細(xì)胞因子的能力降低。NMOSD患者Breg不同表型及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)情況及其作用機(jī)制尚不清楚。故我們研究了CD19+CD24highCD38highBreg在NMOSD急性期患者中的變化。

我們的研究發(fā)現(xiàn)在AQP4-Ab陽性的NMOSD急性期患者外周血中Breg數(shù)量較健康對(duì)照組顯著下降，與之前國內(nèi)外學(xué)者的報(bào)道相一致。研究證明Breg通過分泌IL-10、IL-35、TGF-β等炎癥抑制細(xì)胞因子，實(shí)現(xiàn)負(fù)向免疫調(diào)控，保障免疫平衡。Breg可通過分泌IL-35、TGF-β誘導(dǎo)B細(xì)胞分泌IL-10；通過分泌TGF-β及膜表面的CD80/CD86、GITRL誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞生成；通過分泌IL-10促進(jìn)輔助性T細(xì)胞向Th2分化并且抑制其向Th1的分化[13]。Breg及其細(xì)胞因子可與T細(xì)胞、單核細(xì)胞等之間進(jìn)行動(dòng)態(tài)、多樣的相互作用，在免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮至關(guān)重要的作用[14]。

IL-10是重要的抗炎細(xì)胞因子，對(duì)免疫反應(yīng)的調(diào)控主要是通過抑制過度炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。IL-10可誘導(dǎo)Th0向Th2發(fā)育，誘導(dǎo)Th2細(xì)胞因子，并通過抑制Th1細(xì)胞因子進(jìn)一步抑制Th1發(fā)育，影響Th1/Th2平衡，阻止抗原呈遞。單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子，抑制樹突細(xì)胞分泌細(xì)胞因子如IL-6、IL-12，因IL-12水平下降可抑制EAE進(jìn)程，故IL-10/IL-12平衡在EAE發(fā)病過程中起重要調(diào)節(jié)作用。IL-10通過下調(diào)促炎性細(xì)胞因子、共刺激分子的表達(dá)，從而效應(yīng)T細(xì)胞激活減少，進(jìn)而發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用[15]。TGF-β抑制可細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、Th1型和Th2型細(xì)胞分化，促進(jìn)外周血樹突狀細(xì)胞、Th17-、Th9-和Tfh-細(xì)胞的產(chǎn)生，在維持自身耐受性，控制免疫應(yīng)答方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[16]。有研究采用CD8+CD103+iTreg過繼轉(zhuǎn)移治療典型狼瘡綜合征的慢性移植物抗宿主病，表明可降低自身抗體和蛋白尿水平，減少腎臟病理損害，提高存活率，提示可能與TGF-β和IL-10信號(hào)，直接抑制B細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)。TGF-β在Bregs發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用中占有不可忽視的地位[17]。此外，Breg可能通過產(chǎn)生TGF-β增強(qiáng)Treg的擴(kuò)增[18]。

我們的研究證實(shí)NMOSD患者急性期外周血中IL-10和TGF-β的含量較健康對(duì)照組明顯降低，上述研究結(jié)果提示NMOSD患者外周血Breg不僅數(shù)量減低，在功能上也存在異常，急性期免疫活性增強(qiáng)，免疫平衡紊亂，大量炎癥因子激活，而相應(yīng)抑制功能下降，造成組織損傷，這可能是NMOSD發(fā)病機(jī)制的重要組成部分。

NMOSD急性期AQP4抗體通過受損的BBB與AS足突表面的AQP4特異性結(jié)合， AS受損，GFAP作為AS的重要組成部分，釋放入細(xì)胞間隙，通過BBB進(jìn)入外周血，研究表明NMOSD患者中CSF中的GFAP濃度顯著高于血清，血清中GFAP含量變化的研究相對(duì)少見，也較對(duì)照組水平增加[19]。我們的研究表明NMOSD患者急性期外周血中GFAP水平較健康對(duì)照組顯著升高，與既往研究結(jié)果相一致，反應(yīng)AS損害，BBB破壞，腦組織內(nèi)發(fā)生炎性損傷。但我們的研究并未發(fā)現(xiàn)血清GFAP水平與EDSS評(píng)分之間具有明確相關(guān)性，分析原因可能為，本組患者大部分為復(fù)發(fā)患者，EDSS評(píng)分為多次復(fù)發(fā)后累積殘疾評(píng)分，而檢測(cè)的血清GFAP僅為此次免疫損傷后AS破壞的反應(yīng)，故GFAP不能作為生物學(xué)指標(biāo)反應(yīng)復(fù)發(fā)的NMOSD患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后。