李 霞，王 煒，趙仕琪，槐瑞雪，史肖鶴，李世平，董 梅

隨著基因技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的研究顯示遺傳因素可能與阿司匹林抵抗(AR)相關(guān)，阿司匹林為非選擇性COX抑制劑，通過與環(huán)氧合酶(COX)不可逆乙?；磻?yīng)使酶失活，抑制花生四烯酸(AA)代謝，阻斷血栓素A2(TXA2)介導(dǎo)的血小板聚集。阿司匹林對COX-1及COX-2兩種同工酶均有不可逆抑制作用，但對COX-1的抑制強(qiáng)度是COX-2的170倍，故抗栓療效主要取決于對COX-1的抑制程度。關(guān)于COX-1基因多態(tài)性已被廣泛關(guān)注，國內(nèi)外有文獻(xiàn)報(bào)道，COX-1受體上-1676A>G及C50T、-A842G基因多態(tài)性可能與AR相關(guān)[1]，但尚存在爭議。COX-2屬于誘生型酶，在動(dòng)脈粥樣硬化的慢性炎癥過程中參與血栓形成。有研究報(bào)道，位于COX-2基因啟動(dòng)子區(qū)的-765G/C多態(tài)性可能與AR相關(guān)[2]。

腦梗死復(fù)發(fā)因素眾多，關(guān)于AR基因多態(tài)性與腦梗死復(fù)發(fā)相關(guān)研究較少，本研究旨在探討COX基因多態(tài)性與腦梗死患者發(fā)生AR的關(guān)系。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 采用前瞻性隊(duì)列研究，選取2014年10月-2015年6月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的急性腦梗死患者，入選患者均行頭部MR 1.5T檢查證實(shí)有新發(fā)梗死灶。所有患者均簽署知情同意書。共有70例患者進(jìn)行血栓彈力圖(TEG)檢測和COX-1及COX-2基因分型。住院治療穩(wěn)定后，規(guī)律口服ASP 100 mg/d，半年后進(jìn)行臨床隨訪。通過門診及電話隨訪。以患者發(fā)病時(shí)間為起點(diǎn)，進(jìn)行6個(gè)月隨訪。主要終點(diǎn)事件是指腦梗死復(fù)發(fā)，次要終點(diǎn)事件包括腦出血、心肌梗死以及其他原因?qū)е碌乃劳?。排除?biāo)準(zhǔn)：(1)短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)；(2)服用其他抗血小板藥物或抗凝藥；(3)有嚴(yán)重消化性潰瘍或其他消化系統(tǒng)疾病；(4)血小板計(jì)數(shù)<100×109/L或>400×109/L、血紅蛋白<90 g/L或>169 g/L；(5)有嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤、血液病、惡性高血壓、嚴(yán)重感染及免疫系統(tǒng)疾??；(6)近期有活動(dòng)性出血者；(7)房顫；(8)心源性腦梗死。剔除標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床資料不全；(2)停藥或間斷服用ASP。

1.2 方法 初發(fā)缺血性腦卒中患者在規(guī)律服用ASP 100 mg/d 7 d后晨起空腹采肘部靜脈血5 ml，存放于枸櫞酸鈉抗凝管，采用TEG-5000血栓彈力圖儀(美國Haemonetics公司)及配套試劑檢測。阿司匹林抵抗(AR)定義：TEG通過阿司匹林誘導(dǎo)劑花生四烯酸(arachidonic acid，AA)，使用3個(gè)通道(高嶺土、激活劑F和激活劑F+AA)進(jìn)行檢測。阿司匹林抑制率=(AA誘導(dǎo)的最大血凝塊強(qiáng)度-纖維蛋白的最大血凝塊強(qiáng)度)/(凝血酶誘導(dǎo)的最大血凝塊強(qiáng)度-纖維蛋白的最大血凝塊強(qiáng)度)×100%。阿司匹林抑制率<50%為AR，≥50%為阿司匹林敏感(aspirin sensitive)。根據(jù)TEG測定分為AS組(45例)和AR組(25例)，對兩組一般臨床資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性(見表1)。

1.3 基因提取及測序

1.3.1 DNA提取 采集患者晨起空腹肘靜脈血2 ml，存放入枸櫞酸鈉抗凝管，應(yīng)用DNA提取試劑盒(TIANGEN)，提取全血DNA，-20 ℃保存。

1.3.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和DNA測序 COX-1、COX-2基因變異位點(diǎn)的數(shù)據(jù)獲自HapMap中國漢族人群數(shù)據(jù)庫。將最小等位基因頻率(MAF)下限設(shè)為0.05，并以r2>0.8的原則從HapMap獲得的變異位點(diǎn)中挑選tag SNP。COX-1上-A842G引物：上游5’-CGGTGGATGTGAGTCTAGCTAC-3’，下游5’-GTATTCTCATCTATAAAATCGGCTT-3’，擴(kuò)增長度208 bp。COX-1 C50T引物：上游5’-CGGTGGATGTGAGTCTAGCTAC-3’，下游 5’-GTATTCTCATCTATAAAATCGGCTT-3’，擴(kuò)增長度212 bp。COX-1-1676A>G引物：上游5’-CGGTGGATGTGAGTCTAGCTAC-3’，下游5’- GTATTCTCATCTATAAAATCGGCTT-3’，擴(kuò)增長度250 bp。COX-2上-765G/C引物：上游 5’-CGGTGGATGTGAGTCTAGCTAC-3’，下游5’-GTATTCTCATCTATAAAATCGGCTT-3’，擴(kuò)增長度297 bp。將PCR產(chǎn)物送于上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行DNA測序檢測。

2 結(jié) 果

2.1 SNP檢測結(jié)果

2.1.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 對70例患者DNA進(jìn)行檢測，未發(fā)現(xiàn)COX-1 C50T及-A842G基因位點(diǎn)多態(tài)性。-1676A>G位點(diǎn)中，22例為AA純合子，38例為AG雜合子，10例為GG突變純合子，-1676G等位基因頻率為41.43%。COX-2基因-765G/C位點(diǎn)中，61例為GG純合子，9例為GC雜合子，未發(fā)現(xiàn)CC突變純合子，-765C等位基因頻率為6.43%。COX-1基因-1676A>G及COX-2基因的-765G/C位點(diǎn)等位基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡，表明所選樣本具有群體代表性(見表2)。

2.1.2 COX-1基因-1676A>G位點(diǎn)及COX-2基因-765G/C位點(diǎn)基因型分布結(jié)果 AR組和AS組COX-1基因-1676A>G位點(diǎn)，其G等位基因攜帶兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[76.0% vs 62.2%;P=0.24;OR1.92(0.64～5.76)]；COX-2基因-765G/C位點(diǎn)C等位基因攜帶，AR與AS組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(24.0% vs 6.7%；P=0.089;OR4.42(0.99～19.58)](見表3)。

2.2 臨床隨訪結(jié)果

2.2.1 隨訪結(jié)果 70例初發(fā)腦梗死患者規(guī)律服用阿司匹林的半年隨訪期間，共發(fā)生12例(17.14%)不良事件，其中主要終點(diǎn)事件8例(11.4%)，次要終點(diǎn)事件4例(5.7%)：包括腦出血2例(2.9%)、非致死性心肌梗死1例(1.4%)及死亡1例(1.4%)。AS組與AR組兩組終點(diǎn)事件發(fā)生率比較結(jié)果顯示:腦梗死復(fù)發(fā)患者AR發(fā)生率高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(24.0% vs 4.4%；P=0.021)(見表4)。

2.2.2 隨訪結(jié)果與rs1330344、rs20417基因型比較 COX-2 -765G/C基因攜帶C等位基因與臨床主要終點(diǎn)事件腦梗死復(fù)發(fā)進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[33.3% vs 8.20%;P=0.099;OR5.6(1.06～29.47)]；COX-1 -1676A>G其G等位基因攜帶與腦梗死復(fù)發(fā)無相關(guān)性[14.9% vs 4.35%;P=0.367;OR0.26(0.03～2.25)](見表5)。

表1 基線資料比較

表2 所選位點(diǎn)的基因型頻率分布及Hard-Weinberg平衡檢驗(yàn)

表3 COX-1-1676A>G及COX-2-G765C位點(diǎn)基因型在AS組與AR組比較 [例數(shù)(%)]

表4 隨訪期間兩組終點(diǎn)事件發(fā)生率比較[例(%)]

AS：阿司匹林敏感；AR：阿司匹林抵抗*P<0.05

表5 rs1330344、rs20417基因型與臨床預(yù)后比較[例(%)]

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)共納入70例研究對象，根據(jù)TEG檢測分為AS和AR組，并進(jìn)行為期半年的隨訪，研究發(fā)現(xiàn)AR組主要終點(diǎn)事件腦梗死復(fù)發(fā)(6例)較AS組升高，兩組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，研究顯示AR與腦梗死復(fù)發(fā)相關(guān)。隨著基因技術(shù)的突破進(jìn)展，從分子流行病學(xué)角度研究基因變異對心腦血管疾病的影響及其防治開辟了新的途徑。越來越多的證據(jù)表明，阿司匹林抵抗(Aspirin Resistance,AR)與遺傳的基因易感性相關(guān)，在人群中篩選有關(guān)AR的易感性基因?qū)Ω呶Ｈ巳旱淖R(shí)別及防治具有重要意義。

AR發(fā)生的機(jī)制復(fù)雜且影響因素眾多，一些臨床相關(guān)因素如性別、吸煙、急性冠脈綜合征(ACS)、肥胖、糖尿病、腎功能不全等，可能影響患者基線狀態(tài)下血小板活性從而影響抗血小板治療反應(yīng)性。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前對AR及AS組的臨床基線資料進(jìn)行比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。排除了基線狀態(tài)下混雜因素對阿司匹林敏感性干擾，旨在重點(diǎn)探討COX-1、COX-2基因?qū)Π⑺酒チ织熜У挠绊憽?/p>

本研究選取了COX-1基因的3個(gè)SNP位點(diǎn)，包括-A842G、C50T及-1676A>G以及COX-2基因-765G/C位點(diǎn)。COX-1基因-A842G位點(diǎn)位于COX-1基因的啟動(dòng)子，研究發(fā)現(xiàn)G等位基因(-842G)可以提供一個(gè)額外的結(jié)合位點(diǎn)給轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白(AP2)啟動(dòng)子區(qū)域,阻斷血小板中COX-1的表達(dá)，導(dǎo)致阿司匹林快速抑制COX1酶活性，增加阿司匹林敏感性[4]。它的變異可能影響COX-1的基因表達(dá)及阿司匹林的藥物療效，Ulehlova等[5]對捷克124例急性心肌梗死患者進(jìn)行研究結(jié)果表明AR與COX-1-842G等位基因相關(guān)，其G等位基因的最小等位基因頻率為7.26%，而徐旭等[6]對中國心腦血管患者群進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，COX-1基因-842G與阿司匹林低反應(yīng)性無明顯相關(guān)，Jalil等[7]研究表明中國、馬來西亞和印度人群均沒有COX-1基因-842G等位基因多態(tài)性。COX-1 C50T基因片段位于17位點(diǎn)，是調(diào)節(jié)阿司匹林治療反應(yīng)程度的決定性因素，與-A842G位點(diǎn)呈完全連鎖不平衡，研究發(fā)現(xiàn)C50T基因變異在亞洲人群發(fā)生率極低，Yi等[8]研究發(fā)現(xiàn)中國腦梗死COX-1基因C50T等位基因雜合子僅5.8%，與AR無相關(guān)性。同樣Weng等[9]及Mukarram等[10]研究顯示C50T多態(tài)性與AR無明顯相關(guān)性，本研究選取70例進(jìn)行A-842G及C50T基因測序結(jié)果顯示未發(fā)現(xiàn)野生雜合子及純合子型。與既往發(fā)表的文獻(xiàn)一致，結(jié)果顯示急性腦梗死患者阿司匹林抵抗與-A842G/C50T無相關(guān)性。

而COX-1-1676A>G基因(rs1330344)位于啟動(dòng)子區(qū)，該等位基因在中國漢族人群中發(fā)生率很高。中國老年心血管疾病患者中，COX-1基因-1676A/G攜帶G等位基因 (rs1330344)變異體與阿司匹林耐藥性顯著相關(guān)。Fan等[11]對中國人群進(jìn)行研究分析顯示-1676A>G其G等位基因頻率高達(dá)40%，證實(shí)攜帶G等位基因與AR相關(guān)，曹麗萍等[12]研究發(fā)現(xiàn)-1676A>G基因突變型與服用阿司匹林缺血性事件發(fā)生顯著相關(guān)?？赡芘cGG基因型上調(diào)COX-1 RNA及蛋白質(zhì)表達(dá)增加，從而增加TXA2合成，促進(jìn)血小板聚集，介導(dǎo)血栓形成過程。本研究結(jié)果顯示70例患者中發(fā)現(xiàn)GG型10例(14.2%)、AG型37例(52.9%)、AA型23例(32.9%)，其G等位基因頻率為41.43%，與漢族人種變異基因型GA+GG發(fā)生率相近，本研究發(fā)現(xiàn)AR組GG+AG基因型頻率達(dá)76%,高于AS組(62.2%)，但兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;對70例患者進(jìn)行隨訪發(fā)現(xiàn)主要終點(diǎn)事件腦梗死復(fù)發(fā)其GA+GG基因型頻率達(dá)87.5%，未復(fù)發(fā)組達(dá)64.5%，兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由于樣本量較少，尚不能驗(yàn)證AR及缺血性不良事件發(fā)生與攜帶G等位基因相關(guān)。

COX-2基因位于1號(hào)染色體上，有10個(gè)外顯子，許多研究人員發(fā)現(xiàn)它與阿司匹林的療效有顯著的相關(guān)性[13]。阿司匹林對其抑制作用是COX-1的170倍。90%的TXA2抑制被認(rèn)為是阿司匹林潛在的抗血栓活性。而位于啟動(dòng)子區(qū)域的rs20417(-765G/C)與阿司匹林的應(yīng)答顯著相關(guān)[14]。Sharma等[2]人在一項(xiàng)包括450名缺血性腦卒中患者的研究中發(fā)現(xiàn)，COX-2-765G/C多態(tài)性C等位基因與缺血性腦卒中患者阿司匹林耐藥性之間存在顯著相關(guān)性。另一項(xiàng)Yi X等[15]研究發(fā)現(xiàn)COX-1(rs3842787)和COX-2(rs20417)變異型相互作用與阿司匹林耐藥性顯著相關(guān)。本研究結(jié)果顯示70例患者中攜帶C等位基因突變率達(dá)12.9%，其中C等位基因攜帶在AR組為24%;在AS組為6.7%(P>0.05)。本研究顯示AR組C等位基因攜帶的頻率明顯高于AS組，對攜帶C等位基因患者主要重點(diǎn)事件腦梗死復(fù)發(fā)進(jìn)行比較，其攜帶異位基因的終點(diǎn)事件發(fā)生比例較高，但兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能跟研究的樣本量較少有關(guān)系。

本研究在后續(xù)研究過程中會(huì)加大樣本量，進(jìn)一步驗(yàn)證COX-1-1676A>G基因以及COX-2-765G/C基因是否作為腦梗死患者發(fā)生AR的易患基因，并選取其他SNP位點(diǎn)，進(jìn)一步全面了解AR的基因變異特性，為臨床治療提供新的平臺(tái)。