張釗 涂嬌 張小雪

摘要：為研究嗜水氣單胞菌對(duì)黃鱔Moronecidin基因表達(dá)的影響，用不同濃度嗜水氣單胞菌菌液感染健康黃鱔，采用熒光定量PCR方法分別檢測(cè)染菌黃鱔脾臟、腎臟和肌肉中Moronecidin基因在感染后12、24、48 h的表達(dá)量。結(jié)果表明，Moronecidin基因在健康黃鱔的上述3種組織器官中都有表達(dá);腹腔注射嗜水氣單胞菌后，該基因的表達(dá)量明顯升高。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，3種組織器官中Moronecidin基因的表達(dá)量在處理1（菌液濃度為1億CFU/mL）均呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，處理2（菌液濃度為2億CFU/mL）脾臟中Moronecidin基因的表達(dá)量隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，而腎臟和肌肉中的表達(dá)量則呈先升高后降低的趨勢(shì);處理3（4億CFU/mL）Moronecidin基因的表達(dá)量在3種組織器官中均逐漸降低。

關(guān)鍵詞：黃鱔;嗜水氣單胞菌;Moronecidin基因

中圖分類(lèi)號(hào)： S917? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）10-0188-05

魚(yú)類(lèi)依賴(lài)非特異性免疫系統(tǒng)通過(guò)產(chǎn)生各種免疫細(xì)胞[1-2]、免疫因子[3-4]等非特異性的識(shí)別并作用于病原體，達(dá)到清除體內(nèi)抗原、抵御水生環(huán)境中各種病原體入侵的目的?？咕模ˋMPs）是非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成成分，存在于植物、動(dòng)物以及人類(lèi)等幾乎所有的生命體中，具有抗菌譜廣、高效、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、不產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽除了具有直接抑制細(xì)菌、真菌、病毒和原蟲(chóng)的抗菌活性外，還具有增強(qiáng)免疫細(xì)胞趨化性[7]、抑制炎癥[8-9]和激活免疫細(xì)胞[10]等生物學(xué)活性。

Moronecidin抗菌肽屬于Piscidin（毒魚(yú)豆素）家族，其家族成員包括dicentracin、epinecidin、myxindin以及胸腺素[11]等。2002年Lauth等從雜交條紋鱸魚(yú)（Hybrid striped）的鰓和皮膚中首次分離獲得Moronecidin抗菌肽，并驗(yàn)證了它對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都有抗菌活性[12];2008年Falco等的研究表明，在感染病原體后，虹鱒各組織器官中Moronecidin抗菌肽的表達(dá)量最高[13]。同時(shí)，在其他魚(yú)類(lèi)體內(nèi)也相繼發(fā)現(xiàn)了Moronecidin抗菌肽，包括大西洋鱈魚(yú)（Gadus morhua）[14]、真鯛（Chrysophrys major）[15]、歐洲鱸魚(yú)（Dicentrarchus labrax）[16]、石斑魚(yú)（Epinephelus coioides）[17]等。到目前為止，Moronecidin抗菌肽僅被發(fā)現(xiàn)存在于魚(yú)類(lèi)中。有關(guān)Moronecidin基因的研究發(fā)現(xiàn)，比目魚(yú)完整的Moronecidin基因cDNA序列包含1個(gè)信號(hào)肽和磷酸腺苷（AMP）12域[18]，而條石鯛魚(yú)中Moronecidin基因的編碼區(qū)含有204bp，共67個(gè)氨基酸殘基，并預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)是一種兩親性螺旋結(jié)構(gòu)[19]。前人關(guān)于Moronecidin基因的研究主要集中在海洋魚(yú)類(lèi)，而有關(guān)該基因在淡水魚(yú)黃鱔體內(nèi)表達(dá)的情況尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以黃鱔Moronecidin基因?yàn)檠芯繉?duì)象，通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)該基因在感染嗜水氣單胞菌后黃鱔脾臟等3種組織器官中的表達(dá)量變化，為進(jìn)一步探討黃鱔免疫機(jī)制，實(shí)現(xiàn)新型藥物的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與菌株

試驗(yàn)用60尾黃鱔[體質(zhì)量為（104.5±13.1） g]采集于貴州省貴陽(yáng)市花溪地區(qū)池塘和田間;試驗(yàn)用嗜水氣單胞菌菌株（編號(hào)：ATCC7966）由貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院陳江鳳老師饋贈(zèng)。

1.2 主要儀器設(shè)備和試劑

1.2.1 主要儀器設(shè)備 VD-650超凈工作臺(tái)、101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱、80-1電動(dòng)離心機(jī)、光學(xué)顯微鏡CH20BIMF200、血球計(jì)數(shù)板、FA1004電子天平、78-1磁力加熱攪拌器、HZQ-F160型恒溫?fù)u床、高壓滅菌鍋、80-2112-21型紫外分光光度儀、PTC-1148 PCR擴(kuò)增儀、DYY-6C型電泳儀、NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計(jì)、C1000 Touch熒光定量PCR儀、Universal Hood Ⅱ凝膠成像系統(tǒng)。

1.2.2 主要試劑與試劑盒 無(wú)水乙醇、三氯甲烷、瓊脂糖、Gold View染液[生工生物工程（上海）股份有限公司]、loading buffer[生工生物工程（上海）股份有限公司]、DM2000（鼎國(guó)生物公司）、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒（TIANGEN）、TransStart Tip GreenqPCR SuperMix（TransGen Biotech）、Taq PCR Master Mix（TransGen Biotech）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌液培養(yǎng)及配制 制備LB固體培養(yǎng)基，取儲(chǔ)存的菌株涂抹在培養(yǎng)基上，經(jīng)復(fù)壯后轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中，于28 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，取少量菌液離心提純，加入少量無(wú)菌生理鹽水稀釋后用平板活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定菌液濃度。稀釋菌液濃度至 4億CFU/mL 備用。

1.3.2 試驗(yàn)分組感染 清洗養(yǎng)殖所用水箱，以0.7%生理鹽水浸泡 1 d。將黃鱔隨機(jī)分成4組，每組15尾，放入水箱用無(wú)氯水暫養(yǎng)2 d。對(duì)照組每尾注射0.2 mL生理鹽水。其余3組為處理組，按照注射菌液的濃度分為處理1（每尾黃鱔注射02 mL濃度為1億CFU/mL的嗜水氣單胞菌菌液）、處理2（每尾黃鱔注射0.2 mL濃度為2億CFU/mL的嗜水氣單胞菌菌液）、處理3（每尾黃鱔分別注射0.2 mL濃度為 4億CFU/mL 的嗜水氣單胞菌菌液）。注射后用乙醇棉球?qū)ψ⑸洳课贿M(jìn)行消毒，然后放入水箱中，并加蓋防逃。

1.3.3 組織取樣 分別在感染嗜水氣單胞菌12、24、48 h后進(jìn)行取材，每個(gè)濃度組各時(shí)間點(diǎn)分別取5尾黃鱔，解剖并分別取腎臟、脾臟、肌肉等置于無(wú)酶冷凍管中，迅速放入液氮冷凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的抗菌肽Moronecidin基因序列，并參考GenBank中該基因序列，使用Primer Premier 5.0進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)，參照王霞等的研究結(jié)果[20]，內(nèi)參基因選擇黃鱔的β-actin基因。引物合成由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成，用去離子水溶解后于-20 ℃保存。引物序列信息如表1所示。

1.3.5 樣品總RNA的提取及檢測(cè)

1.3.5.1 總RNA的提取 使用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的RNAsimple Total RNA Kit進(jìn)行總RNA的提取。

1.3.5.2 總RNA的檢測(cè) 對(duì)RNA樣品進(jìn)行超微量紫外分光光度和凝膠電泳雙重檢測(cè)。凝膠制備和電泳檢測(cè)：稱(chēng)取瓊脂糖0.66 g，裝入錐形瓶中，加入70 mL TAE緩沖液，加熱煮沸后于室溫靜置冷卻至50 ℃左右，加入核酸染料5 μL，搖勻后迅速倒膠。將提取的總RNA樣品置于冰上解凍，取1 μL loading buffer（上樣緩沖液）與4 μL RNA樣品混合，點(diǎn)樣，電泳。

1.3.6 cDNA第一鏈的合成 選擇質(zhì)量較高的RNA樣品進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，合成前將樣品RNA濃度調(diào)成一致，使用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的試劑盒對(duì)提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按說(shuō)明書(shū)步驟在冰上進(jìn)行操作（為減少試驗(yàn)誤差，保證每個(gè)反應(yīng)管準(zhǔn)確加入反應(yīng)液，進(jìn)行反應(yīng)前將各反應(yīng)液按比例混合配成混合液，再分裝到各管），具體如下：

（1）將RNA樣品以及反轉(zhuǎn)錄試劑盒內(nèi)所有試劑解凍后置于冰上，使用前用漩渦振蕩器混勻并簡(jiǎn)短離心。

（2）去除基因組：配制混合液（2 μL 5×gDNA緩沖液，1 μL 總RNA，用RNase-Free ddH2O補(bǔ)足至10 μL），充分混勻并簡(jiǎn)短離心，42 ℃條件下孵育3 min后置于冰上。

（3）配制混合液（2 μL 10×Fast RT Buffer，1 μL RT Enzyme Mix，2 μL FQ-RT Primer Mix，用RNase-Free ddH2O補(bǔ)足至10 μL），混勻，簡(jiǎn)短離心。

（4）將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的Mix，加到gDNA去除步驟的反應(yīng)液中，充分混勻，簡(jiǎn)短離心，42 ℃孵育15 min。

（5）95 ℃孵育3 min后置于冰上，所得cDNA用β-actin引物進(jìn)行擴(kuò)增以檢測(cè)質(zhì)量，用于后續(xù)試驗(yàn)或低溫保存。

1.3.7 PCR反應(yīng)體系及程序

1.3.7.1 PCR反應(yīng)體系 20 μL PCR反應(yīng)體系如下：Taq PCR Master Mix 10 μL（1×），模板cDNA 1 μL （0.1～10 ng），Primer F（10 μmol/L） 1 μL（0.5 μmol/L），Primer R（10 μmol/L） 1 μL（0.5 μmol/L），RNase-Free ddH2O 7 μL。

1.3.7.2 Moronecidin PCR反應(yīng)程序 反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，31個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min。

1.3.8 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的基因 稱(chēng)取0.66 g瓊脂糖倒入錐形瓶中，加入60 mL 1×TAE緩沖液，加熱煮沸溶解后，放置于室溫下冷卻至50～60 ℃（不燙手），加入5 μL Gold View染液，用玻璃棒攪拌均勻，迅速倒入制膠板，插入梳子。冷卻凝固后取出梳子，加樣，放入電泳槽，100 V電泳20 min左右，凝膠成像。

1.3.9 Moronecidin基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定 以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA作為熒光定量PCR的模板，對(duì)Moronecidin基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：

（1）熒光定量PCR反應(yīng)體系。20 μL熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：10 μL 2× TransStart Tip Green qPCR SuperMix，0.4 μL（0.2 μmol/L）Primer-F，0.4 μL（0.2 μmol/L） Primer-R，2 μL模板cDNA，7.2 μL RNase-Free ddH2O。

（2）熒光定量 PCR 反應(yīng)條件（兩步法）。具體步驟如下：94 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s，51 ℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)采集;95 ℃ 1 min，51 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，得到溶解曲線。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

本試驗(yàn)所得實(shí)時(shí)熒光定量PCR原始數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCT方法進(jìn)行處理，分析Moronecidin基因在黃鱔腎臟等3種組織器官中的表達(dá)量。處理后的數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行單因素統(tǒng)計(jì)分析，所得數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取結(jié)果

試驗(yàn)共提取了108個(gè)總RNA樣品。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)顯示，總RNA的濃度在130～800 ng/μL之間，且D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0之間，證明總RNA濃度和純度較高。電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，28S和18S條帶清晰，證明總RNA完整，可用于后續(xù)PCR試驗(yàn)。

2.2 cDNA檢測(cè)及β-actin cDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

取1 μL cDNA，超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果顯示，cDNA濃度均在1 000 ng/μL以上，且D260 nm/D280 nm值在 1.8～2.0之間，說(shuō)明cDNA濃度較高且完整，可用于下一步熒光定量PCR試驗(yàn)。由圖1可知，以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，用β-actin引物進(jìn)行擴(kuò)增，并通過(guò)凝膠電泳成像進(jìn)行檢測(cè)，得到的條帶分明，無(wú)雜帶，每組獲得的DNA片段均在 344 bp 左右，說(shuō)明β-actin基因在黃鱔RNA樣品中的表達(dá)穩(wěn)定，可作為內(nèi)參基因使用。

2.3 cDNA的PCR擴(kuò)增

分別在健康黃鱔3種組織器官樣品中挑選4個(gè)cDNA樣品作為模板，對(duì)Moronecidin目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并成像（圖2），所得條帶單一明亮，每組均擴(kuò)增得到約291 bp的DNA片段，說(shuō)明Moronecidin基因在健康黃鱔中有表達(dá)。

2.4 引物特異性檢測(cè)

通過(guò)qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)分析感染嗜水氣單胞菌后黃鱔各時(shí)間點(diǎn)脾臟、腎臟、肌肉組織中Moronecidin基因的表達(dá)量，得到β-actin基因擴(kuò)增曲線和溶解曲線（圖3）、Moronecidin基因擴(kuò)增曲線和溶解曲線（圖4）。由圖3和圖4可以看出，2個(gè)基因擴(kuò)增曲線均呈“S”形，且曲線平行性好，2個(gè)基因的溶解溫度分別為82.5 ℃和86.5 ℃，溶解曲線峰值單一，說(shuō)明設(shè)計(jì)的熒光定量引物特異性較好，沒(méi)有引物二聚體和產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。

2.5 Moronecidin基因表達(dá)量的變化

以β-actin為內(nèi)參作對(duì)照，在不同處理濃度和處理時(shí)間下，對(duì)Moronecidin基因在黃鱔3種組織器官中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果采用2-ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果以對(duì)照組 12 h 的表達(dá)量為對(duì)照，設(shè)置其數(shù)值為1。

2.5.1 脾臟Moronecidin基因的表達(dá) 由圖5可知，隨著試驗(yàn)時(shí)間的推移，對(duì)照組脾臟Moronecidin基因的表達(dá)量有些許升高 但差異不明顯。處理1和處理2在感染嗜水氣單胞菌后，Moronecidin基因表達(dá)量均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，且增加顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）;處理2在感染24 h和48 h時(shí)Moronecidin基因表達(dá)量極顯著提高（P<0.01）;而處理3則隨感染時(shí)間的延長(zhǎng)，Moronecidin基因表達(dá)量與對(duì)照相比呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量下降十分明顯。與對(duì)照組相比，各處理組Moronecidin基因表達(dá)量整體呈上調(diào)趨勢(shì)，處理2在感染48 h時(shí)，基因表達(dá)量達(dá)到最高值。

2.5.2 腎臟Moronecidin基因的表達(dá) 由圖6可知，隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組腎臟Moronecidin基因相對(duì)表達(dá)量有些許變化，但差異不明顯。各處理組在感染初期，腎臟Moronecidin基因表達(dá)量均增加，隨著處理菌液濃度的升高，Moronecidin基因表達(dá)量在12 h內(nèi)均增加;處理2在24 h達(dá)到最高值，而處理3在12 h與對(duì)照相比增加極顯著;處理2的相對(duì)表達(dá)量在12～48 h內(nèi)呈先增加后降低的趨勢(shì)，處理3則持續(xù)降低。

2.5.3 肌肉Moronecidin基因的表達(dá) 由圖7可知，對(duì)照組肌肉中Moronecidin基因相對(duì)表達(dá)量變化不明顯。與對(duì)照組相比，在感染嗜水氣單胞菌后，黃鱔肌肉中Moronecidin基因表達(dá)量均升高;處理1該基因的表達(dá)量隨著處理時(shí)間的增加而增加，而處理2先增加后降低，在感染24 h時(shí)該基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高值，差異極顯著，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，該基因表達(dá)量又明顯下降;處理3在感染初期該基因的表達(dá)量最高，而后持續(xù)下降到對(duì)照組水平。

3 討論

3.1 Moronecidin基因在不同魚(yú)類(lèi)器官中的表達(dá)量

研究表明，Moronecidin基因在多種健康魚(yú)類(lèi)的各組織器官（如脾臟、腎臟、肝臟、肌肉、心臟、胃等）中均有表達(dá)，但表達(dá)量的差異并不顯著。用細(xì)菌或病毒誘導(dǎo)后，Moronecidin基因表達(dá)量顯著升高，且在不同器官中的表達(dá)量變化情況不同：條石鯛（Oplegnathus fasciatus）在感染真鯛虹彩病毒后，Moronecidin基因表達(dá)量顯著升高，且在脾臟中的表達(dá)量最高，在頭腎和鰓中次之[19];通過(guò)注射殺鮭氣單胞菌進(jìn)行誘導(dǎo)，提高了大西洋鱈魚(yú)（Gadus morhua）脾臟、頭腎中Moronecidin基因表達(dá)量，且脾臟中24 h時(shí)的表達(dá)量變化最顯著[21]。與前人的研究結(jié)果類(lèi)似，本試驗(yàn)中Moronecidin基因在健康黃鱔的脾臟、腎臟和肌肉中均有表達(dá)，且該基因的表達(dá)量在感染嗜水氣單胞菌初期均明顯上調(diào)，隨注射菌液的濃度升高而發(fā)生顯著變化。在脾臟中該基因的表達(dá)量相比另外2種組織器官高，其次是腎臟，肌肉中的表達(dá)量相對(duì)較低。試驗(yàn)結(jié)果表明，在魚(yú)類(lèi)受到病菌感染時(shí)，Moronecidin基因在免疫系統(tǒng)中的表達(dá)量顯著增加，說(shuō)明其編碼的抗菌肽參與了抵抗病菌的侵?jǐn)_。但對(duì)于不同的魚(yú)和感染不同的菌時(shí)，其表達(dá)量升高的時(shí)間和升高的量卻有所不同。

3.2 Moronecidin基因的表達(dá)量與黃鱔臟器功能的相關(guān)性

在感染嗜水氣單胞菌48 h后，處理2和處理3的3種組織器官中Moronecidin基因表達(dá)量均有下降趨勢(shì)，推測(cè)原因可能是感染初期，黃鱔機(jī)體的免疫應(yīng)答功能正常，Moronecidin基因表達(dá)量隨著感染時(shí)間和感染菌濃度的增加逐漸增加;但在感染后期，黃鱔身體的免疫功能不敵病菌的攻擊，黃鱔臟器免疫應(yīng)答能力下降，導(dǎo)致黃鱔抗菌肽合成能力降低。這是影響Moronecidin基因后期表達(dá)量的可能原因之一。

3.3 嗜水氣單胞菌感染和取材時(shí)間的確定

研究表明，黃鱔在感染嗜水氣單胞菌12 h后就開(kāi)始表現(xiàn)出出血病的癥狀[22]，其臟器功能受到嚴(yán)重?fù)p傷，72 h后全部死亡[23]。本試驗(yàn)根據(jù)前人的研究以及預(yù)試驗(yàn)的情況，選擇在48 h內(nèi)取材，以避開(kāi)染菌黃鱔全部死亡而無(wú)材料可取的問(wèn)題。

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