楊小丹 李枝林 王京 劉一鳴 陳貴春 劉丹 王玉英

摘要：以24個(gè)大花惠蘭品種為母本，32個(gè)國(guó)蘭品種為父本，通過(guò)人工正交雜交共產(chǎn)生45個(gè)組合，研究雜交結(jié)莢率與花粉活力和柱頭可授性之間的關(guān)系。結(jié)果表明，國(guó)蘭花朵開(kāi)放0～20 d的花粉活力處于增長(zhǎng)期，之后花粉活力隨花朵開(kāi)放時(shí)間的增加而降低?；ǘ溟_(kāi)放相同天數(shù)的不同國(guó)蘭品種間的花粉活力差異較大，活力范圍為20%～95%。大花蕙蘭花朵開(kāi)放20～25 d時(shí)柱頭都具可授性，不同品種間有差異。45個(gè)雜交組合中有22個(gè)組合獲得發(fā)育成熟的果莢，結(jié)莢組合率為48.89%，落果組合率為51.11%。從授粉到果莢成熟需要175～200 d，成熟果實(shí)結(jié)莢率為80%～100%的有9個(gè)組合，其中6個(gè)組合花粉活力>73%，柱頭可授性很強(qiáng)，3個(gè)組合花粉活力<50%，2個(gè)組合柱頭可授性強(qiáng)和1個(gè)柱頭可授性弱;結(jié)莢率為50%～80%的有3個(gè)組合，花粉活力>67%，2個(gè)組合柱頭可授性強(qiáng)和1個(gè)組合的柱頭可授性弱;結(jié)莢率<50%有10個(gè)組合，其中1個(gè)組合花粉活力<50%，柱頭可授性強(qiáng)，其他9個(gè)組合花粉活力≥50%，柱頭可授性強(qiáng);落果率即結(jié)莢率為0的雜交組合表現(xiàn)為授粉后子房膨大，生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)黃苞落果。表明花粉活力、柱頭可授性的強(qiáng)弱對(duì)結(jié)莢率有一定的影響，一般表現(xiàn)為花粉活力與柱頭可授性越強(qiáng)結(jié)莢率越高，反之亦然?；ǚ刍盍εc柱頭可授性可作為雜交授粉能否結(jié)莢的重要指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：蘭花;花粉活力;柱頭可授性;雜交;結(jié)莢率;大花惠蘭;國(guó)蘭

中圖分類(lèi)號(hào)：S682.310.3?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）10-0166-07

蘭花是世界名花和我國(guó)家喻戶曉的傳統(tǒng)名花，也是云南省八大名花之一。廣義的蘭花是蘭科植物的統(tǒng)稱，俠義的蘭花常指蘭屬植物及部分具有較高觀賞價(jià)值的類(lèi)型，按照蘭花的生態(tài)類(lèi)型，可將蘭花分為地生蘭、附生蘭及腐生蘭3類(lèi)[1-3]。大花蕙蘭（Cymbidium hybridum）為蘭科（Orchidaceae）蘭屬（Cymbidium）多年生草本植物，附生蘭類(lèi)，是蘭屬植物通過(guò)人工雜交培育出的品種統(tǒng)稱[4]。大花惠蘭株型高大、花大色艷、花期長(zhǎng)、花無(wú)香味、適應(yīng)性強(qiáng)，既可做盆栽，也可做切花，花期10月至次年4月[5-8]。國(guó)蘭（Chinese Cymbidium）是指蘭科蘭屬中的部分地生類(lèi)植物，包括春蘭（C. goeringii）、春劍（Cymbidium goeringii）、蓮瓣蘭（C. lianpan）、蕙蘭（C. faberi）、建蘭（C. ensifolium）、墨蘭（C. sinense）和寒蘭（C. kanran）等7個(gè)種[9]。具有花型小巧、極具芳香、葉態(tài)優(yōu)美等特點(diǎn)[10-12]，從而使國(guó)蘭成為世界上最早的盆栽觀葉植物之一[9]，花期2月至5月[13]。雜交育種是蘭花育種最傳統(tǒng)、最重要的方法，通過(guò)雜交育種工作將大花蕙蘭與國(guó)蘭品種的優(yōu)良性狀相結(jié)合，有望培育出花大色艷、株型緊湊美觀且極具幽香的蘭花新品種[14]。

蘭花雜交的特殊性在于蘭花種內(nèi)或是種間雜交都可以獲得成功，并且與蘭科其他植物進(jìn)行屬間雜交有時(shí)也可以獲得雜交后代[15]。用獨(dú)占春（C.eburneum）和碧玉蘭（C. lowianum）雜交獲得的“韋奇”（C. vietchii）是世界上首個(gè)大花蕙蘭人工雜交品種[16]。再利用美花蘭（C.insigne）和“韋奇”、碧玉蘭進(jìn)行雜交，獲得性狀較好的粉色與白色品種，將這些品種再進(jìn)行雜交，又得到了紫紅色、橘黃色等新品種[17]。國(guó)外，尤其是韓國(guó)和日本，對(duì)國(guó)蘭的雜交育種工作開(kāi)展較早，關(guān)于這方面的研究報(bào)道也比較詳細(xì)[18]。我國(guó)的雜交育種工作起步比較晚，2000年以前，只有中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所的和四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院[19]。近幾年這方面的工作日益增多，朱根發(fā)等進(jìn)行了大花蕙蘭、墨蘭、建蘭、紋瓣蘭、兔耳蘭等蘭屬植物的種間遠(yuǎn)緣雜交試驗(yàn)[16]。李枝林等以蘭屬的6個(gè)種為重點(diǎn)進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交育種技術(shù)研究，培育出4個(gè)雜交種試管苗[20]。陳瑤瑤等以大花蕙蘭和墨蘭雜交育成的品種為母本與蕙蘭進(jìn)行了種間遠(yuǎn)緣雜交[21]。李玉萍等以10個(gè)中國(guó)蘭品種和8個(gè)大花蕙蘭品種為材料開(kāi)展了蘭屬植物間的雜交試驗(yàn)[22]。

大花蕙蘭雜交育種已有100多年的歷史，至今已登錄的大花蕙蘭品種數(shù)以千計(jì)。親本主要是大花蕙蘭的附生蘭類(lèi)，常常要經(jīng)過(guò)多次反復(fù)的雜交才能形成有價(jià)值的品種。目前對(duì)于大花蕙蘭的育種方法仍以雜交為主，但存在很多問(wèn)題，如難于打破生物物種的限制、周期長(zhǎng)、某些優(yōu)良性狀難以保持等[23]?；ǚ刍盍椭^可授性是雜交結(jié)實(shí)的基本條件，目前已在野生煙草、萬(wàn)壽菊、金線蓮等一系列的雜交中有報(bào)道，凌春英等采用TTC染色法和離體培養(yǎng)法對(duì)大花蕙蘭和墨蘭的花粉活力及貯藏進(jìn)行了研究[14]。但目前較為流行的大花蕙蘭栽培品種的柱頭可授性和國(guó)蘭花粉活力對(duì)雜交結(jié)莢率的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以栽培較流行的24個(gè)大花惠蘭品種為母本，采用聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫反應(yīng)測(cè)定柱頭可授性;32個(gè)國(guó)蘭品種為父本，采用TTC染色法檢測(cè)花粉活力，通過(guò)傳統(tǒng)的雜交育種方法研究雜交結(jié)莢率與花粉活力和柱頭可授性之間的關(guān)系，以期為大花蕙蘭與國(guó)蘭雜交育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)花粉活力檢測(cè)于2015年12月至2016年1月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉研究所進(jìn)行，授粉工作于2016年1月在昆明市嵩明縣進(jìn)行。

材料為32個(gè)在云南省采集的國(guó)蘭品種和24個(gè)在云南省昆明市嵩明縣基地種植的大花惠蘭品種，根據(jù)中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測(cè)試指南 蘭屬》對(duì)植株的形態(tài)進(jìn)行描述（表1）。國(guó)蘭有9個(gè)春蘭品種、8個(gè)春劍品種、1個(gè)蕙蘭品種、14個(gè)蓮瓣蘭品種，植株中小型，花色主要集中為黃色、紅色和綠色，具花香，花朵小型;大花蕙蘭植株和花朵有大型和中小型，花色主要集中為黃色、紅色和綠色，花朵鮮艷，6個(gè)品種（中小型植株）具有花香。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉活力測(cè)定 為研究不同國(guó)蘭品種單朵花開(kāi)放不同時(shí)間與花粉活力的關(guān)系，以紅海棠、太極圣梅、美麗之冠、心心相印、滇荷5個(gè)品種為材料，取花朵開(kāi)放0、10、20、30、40 d共5個(gè)不同開(kāi)放時(shí)間的花粉，以TTC染色法分析其花粉活力，試驗(yàn)重復(fù)3次。

為測(cè)定花朵開(kāi)放同一時(shí)間不同國(guó)蘭品種的花粉活力，以授粉當(dāng)天開(kāi)放花朵的花粉為材料，用TTC染色法對(duì)32個(gè)國(guó)蘭的花粉活力進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)重復(fù)3次。

國(guó)蘭開(kāi)放時(shí)間為15～25 d，選擇晴天10：00在溫室中采集花朵，放入保鮮袋中做上標(biāo)記，迅速帶到實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行檢測(cè)。將花粉剝離在載玻片上，用牙簽將花粉壓碎，滴入0.5%TTC[24-25]溶液染色，蓋上蓋玻片，放入恒溫箱中12 h，染色后在100倍體視鏡下觀察每個(gè)品種的染色情況，統(tǒng)計(jì)花粉染色率，試驗(yàn)重復(fù)3次。

花粉活力=（有活力的花粉/觀察花粉總數(shù)）×100%。

1.2.2 柱頭可授性檢測(cè) 花朵開(kāi)放時(shí)間為20～25 d，選擇晴天10：00在溫室中采集花絮中間花朵，放入保鮮袋中做上標(biāo)記，迅速帶到實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行檢測(cè)。將采集到的新鮮大花蕙蘭花朵剪下舌狀花柱頭，將其浸入含有聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫反應(yīng)液（1%聯(lián)苯胺-3%過(guò)氧化氫-水體積比為4 ∶ 11 ∶ 22）[26-27]中，觀察柱頭在溶液中的反應(yīng)，觀察10 min，若柱頭有可授性則會(huì)使柱頭及其周?chē)磻?yīng)液變藍(lán)并出現(xiàn)大量氣泡。這主要是因?yàn)橹^內(nèi)的氧化物酶活性能降解過(guò)氧化氫、氧化聯(lián)苯胺。根據(jù)柱頭周?chē)兯{(lán)的區(qū)域大小以及出現(xiàn)氣泡的多少來(lái)判斷柱頭可授性的強(qiáng)弱。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 授粉 在云南省昆明市嵩明縣基地大棚內(nèi)進(jìn)行，環(huán)境條件為溫度10～25 ℃，濕度60%～70%，光照度10 000～20 000 lx。所選用的雜交手段為正交雜交法。當(dāng)花朵開(kāi)放 20～25 d時(shí)開(kāi)始授粉，一般授粉選擇在晴天進(jìn)行，授粉前先把國(guó)蘭花粉塊頂端的藥帽去掉，再把大花蕙蘭花粉塊用干凈的鑷子輕輕取下來(lái)，之后將國(guó)蘭的花粉塊放入大花蕙蘭的蕊腔中，在塑料紙牌上寫(xiě)明雜交組合名稱、雜交時(shí)間，固定在母本植株上。授粉完成后加強(qiáng)管理。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。用DPS軟件分析數(shù)據(jù)，Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 花朵開(kāi)放不同時(shí)間對(duì)花粉活力的影響

從圖1可以看出，在花朵開(kāi)放0～40 d期間，5個(gè)國(guó)蘭品種的花粉活力呈現(xiàn)隨著花朵開(kāi)放天數(shù)增加，花粉活力先逐漸增強(qiáng)，達(dá)到一定開(kāi)放時(shí)間后，花粉活力有下降的趨勢(shì)。不同品種花朵開(kāi)放0～20 d時(shí)花粉活力處于增長(zhǎng)期，開(kāi)放15-25 d時(shí)花粉活力均出現(xiàn)最高值，隨開(kāi)放時(shí)間的延長(zhǎng)，5個(gè)品種的花粉活力均下降。同一開(kāi)放天數(shù)的不同品種之間花粉活力差異較明顯，太極圣梅花朵開(kāi)放20 d花粉活力高達(dá)95%，滇荷花粉活力僅為20%。從表2可以看出，花朵開(kāi)放期間，5個(gè)國(guó)蘭品種的花粉活力存在顯著性差異，其中太極圣梅花粉活力最強(qiáng)，顯著或極顯著高于紅海棠、心心相印、美麗之冠和滇荷。結(jié)果表明5個(gè)國(guó)蘭品種花粉活力均在花朵開(kāi)放20 d時(shí)出現(xiàn)最高峰值，各品種間花粉活力差異顯著。因此雜交授粉時(shí)選擇開(kāi)放時(shí)間在 15～25 d盛開(kāi)的花朵花粉，以保證具有較高的結(jié)實(shí)率。

2.2 32個(gè)國(guó)蘭品種植株花粉活力的測(cè)定

從表3可以看出，國(guó)蘭花粉活力范圍為20%～95%。太極圣梅的花粉活力最高，為95%;滇荷的花粉活力最低，為20%?；ǚ刍盍υ?0%及以上的有6個(gè)品種，花粉活力在 50%～79%的有15個(gè)品種，花粉活力在50%以下的有11個(gè)品種。圖2為顯微鏡下的花粉活力。

2.3 24個(gè)大花蕙蘭品種植株的花朵柱頭可授性檢測(cè)

由表4、圖3可知，花朵開(kāi)放時(shí)間為20～25 d時(shí)，24個(gè)大花蕙蘭品種植株的花朵柱頭均具備可授性，其中8個(gè)品種的柱頭可授性很強(qiáng)，13個(gè)品種的柱頭可授性強(qiáng)，3個(gè)品種的柱頭可授性弱。

2.4 大花蕙蘭與國(guó)蘭雜交結(jié)莢率

表5、圖4結(jié)果顯示，45個(gè)雜交授粉組合，授粉30 d均表現(xiàn)有花朵迅速枯萎或柱頭閉合、子房膨大等授粉反應(yīng)，其中22個(gè)授粉組合獲得發(fā)育成熟的果莢，結(jié)莢組合比率為 48.89%;其中結(jié)莢率為100%的有5個(gè)組合，結(jié)莢率為 60%～99%的有5個(gè)組合，結(jié)莢率為60%以下的有12個(gè)組合;落果組合比率為44.44%;落果高峰期在授粉45～80 d和95～146 d期間。22個(gè)結(jié)莢組合中果莢發(fā)育成熟的時(shí)間有差異，從授粉到果莢成熟需要約175～200 d。

雜交授粉組合中結(jié)莢率80%～100%的有9個(gè)組合，其中6個(gè)組合父本花粉活力>73%，柱頭可授性很強(qiáng)，紅滿天×綠翡翠父本的花粉活力<50%導(dǎo)致結(jié)莢率<100%，鳳羽峽 觀× 愛(ài)神父本的花粉活力<50%且母本的柱頭可授性弱導(dǎo)致結(jié)莢率<100%，但日本櫻花×玉皇大帝組合花粉活力與柱頭可授性都弱，結(jié)莢率為100%，具體原因需要進(jìn)一步研究;結(jié)莢率50%～80%的有3個(gè)組合，其中3個(gè)組合父本的花粉活力>67%，2個(gè)母本柱頭可授性強(qiáng)，1個(gè)母本的柱頭可授性弱;結(jié)莢率<50%的有10個(gè)組合，其中9個(gè)組合父本的花粉活力≥50%，柱頭可授性強(qiáng)，荷之冠×夢(mèng)境組合父本花粉活 力<50%，柱頭可授性強(qiáng);結(jié)莢率為0的有23個(gè)組合，其中有4個(gè)組合父本的花粉活力>80%，柱頭可授性強(qiáng)，8個(gè)組合花粉活力>50%，柱頭可授性強(qiáng)，11個(gè)組合父本花粉活力<50%，柱頭可授性強(qiáng)，具體原因還需進(jìn)一步研究闡明?；ǚ刍盍椭^可授性一般表現(xiàn)為越高其授粉成功率越高，反之亦然。

上述所有雜交組合，授粉后均表現(xiàn)出子房膨大的現(xiàn)象，但出現(xiàn)黃苞落果導(dǎo)致敗育。雜交不成功的組合子房膨大，但在2周內(nèi)開(kāi)始脫落。本試驗(yàn)觀察到子房脫落的方式是整個(gè)子房變黃而脫落，這是一種比較常見(jiàn)的脫落方式。本試驗(yàn)中雜交失敗的有23個(gè)組合，其中12個(gè)組合花粉活力≥50%，柱頭可授性強(qiáng)，但在發(fā)育過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)不同時(shí)間段的脫落導(dǎo)致未能采收到成熟的果莢，其原因可能是授粉已成功，但后期的發(fā)育受阻，具體原因還需要進(jìn)一步研究闡明。

3 結(jié)論與討論

花粉活力是指花粉具有存活、生長(zhǎng)、萌發(fā)或發(fā)育的能力。李懋學(xué)等對(duì)我國(guó)部分野生的菊屬植物和栽培菊花進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)的觀察，發(fā)現(xiàn)異源多倍體和非整倍體在花粉形成過(guò)程中，其減數(shù)分裂過(guò)程都會(huì)有不同程度的異?，F(xiàn)象，會(huì)導(dǎo)致形成活力低的花粉或不育的花粉[28]。蘭花花粉屬于二核型花粉，具有厚實(shí)的外壁，能忍耐干燥，壽命長(zhǎng)，比較容易保存[29]。本研究國(guó)蘭的花粉來(lái)源于9個(gè)春蘭品種，8個(gè)春劍品種，1個(gè)蕙蘭品種和14個(gè)蓮瓣蘭品種，不同品種花粉活力高低可能與其遺傳來(lái)源有關(guān)。除此之外，本研究發(fā)現(xiàn)不同國(guó)蘭品種花粉保持活力的時(shí)間與花朵開(kāi)放的時(shí)間有關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果表明，5個(gè)國(guó)蘭品種的花粉活力呈現(xiàn)隨著花朵開(kāi)放時(shí)間延長(zhǎng)，花粉活力增強(qiáng)，達(dá)到一定開(kāi)放天數(shù)后，花粉活力下降的趨勢(shì)。這與褚怡等在大花蕙蘭與國(guó)蘭花粉活力及柱頭可授性分析中的結(jié)論[30]一致。不同品種間花粉保持活力的時(shí)間有差異[30]，這與羅遠(yuǎn)華等在文心蘭花粉活力與雜交結(jié)莢性研究中的結(jié)論[31]一致。

柱頭可授性的檢測(cè)方法很多，其中定期授粉觀察花粉萌發(fā)較準(zhǔn)確，可靠程度高，但需要的時(shí)間相對(duì)要長(zhǎng)，較為復(fù)雜。而采用聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫染色檢測(cè)柱頭可授期較為簡(jiǎn)單，在多數(shù)植物中得到應(yīng)用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，此方法在大花蕙蘭中也適用。柱頭可授性強(qiáng)弱與過(guò)氧化物酶活性有關(guān)，并與柱頭形態(tài)特征具有相關(guān)性。不同植物的柱頭可授期所持續(xù)的時(shí)間不同，從幾小時(shí)到十幾天不等，花期的長(zhǎng)短、開(kāi)花后的天數(shù)以及柱頭分泌物的有無(wú)等對(duì)其均有重要的影響，甚至柱頭長(zhǎng)短不同的同一種植物其柱頭可授性也有差異[32-33]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，大花蕙蘭花朵開(kāi)放時(shí)間為20～25 d時(shí)，24個(gè)大花蕙蘭品種植株的花朵柱頭均具備可授性。這與褚怡在大花蕙蘭與國(guó)蘭花粉活力及柱頭可授性分析中得出大花蕙蘭不同品種間柱頭可授性差異不大，20～40 d內(nèi)可授性達(dá)到最強(qiáng)的結(jié)論一致。

羅遠(yuǎn)華在文心蘭花粉活力與雜交結(jié)莢性研究中以花粉活力較高的文心蘭材料為父本雜交時(shí)，14個(gè)授粉組合有9個(gè)組合能結(jié)莢，具有較高的結(jié)莢率，以花粉活力較低的品種為父本時(shí)，5個(gè)授粉組合均不能結(jié)莢，表明文心蘭花粉活力的高低對(duì)雜交授粉結(jié)莢率有重要影響[31]。本試驗(yàn)以花粉活力較高的材料寶晶、紅海棠、素牡丹、太極圣梅、領(lǐng)帶花為父本時(shí)，9個(gè)授粉組合中有6個(gè)能結(jié)莢，且結(jié)莢率較高;以花粉活力較低的滇荷品種為父本時(shí)，授粉組合均不能結(jié)莢。結(jié)果表明，花粉活力越高其授粉成功率越高，反之則越低。國(guó)蘭花粉活力不僅可作為雜交授粉能否結(jié)莢的重要指標(biāo)，而且可以直接指導(dǎo)雜交親本的選配，提高雜交結(jié)莢率，這與臺(tái)灣學(xué)者的研究結(jié)論[34]一致。

相關(guān)研究表明，大花蕙蘭在其育種歷程中，有不同程度的染色體加倍現(xiàn)象出現(xiàn)，使其倍性復(fù)雜化，有二倍體，也有三倍體或四倍體，但以三倍體居多;而中國(guó)蘭大多為二倍體。倍性不同的父母本雜交時(shí)受精情況不良、合子胚的發(fā)育不正常、正常胚的數(shù)量很少等均會(huì)導(dǎo)致果實(shí)敗育。此外倍性差異引起無(wú)法形成正常配子及存在的生殖隔離也會(huì)對(duì)雜交果實(shí)的發(fā)育產(chǎn)生很大影響。本研究中23個(gè)雜交組合的結(jié)莢率為0，其中的12個(gè)組合花粉活力>50%，柱頭可授性強(qiáng)，這可能與大花蕙蘭的倍性有關(guān)，需進(jìn)一步研究。張志勝等曾報(bào)道以墨蘭為母本，大花蕙蘭為父本的雜交結(jié)實(shí)率明顯高于反交結(jié)實(shí)率[35-36]，本研究以大花蕙蘭為母本的雜交結(jié)莢組合率小于落果組合率，可能與品種有關(guān)，具體原因還需進(jìn)一步研究闡明。

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