胡燦 劉峰 王運生

摘要：為了初步研究辣椒（Capsicum annuum L.）NRAMP家族基因在重金屬鎘脅迫下的表達情況，通過生物信息學方法從辣椒基因組中鑒定出NRAMP基因，并對這些基因的序列結構、系統(tǒng)進化樹、表達譜等進行系統(tǒng)分析。結果表明，辣椒中含有5個具有典型NRAMP結構域的基因，根據其在染色體上的位置，分別將其命名為CaNRAMP1～CaNRAMP5，根據系統(tǒng)進化分析，將辣椒的NRAMP基因分為2類，Ⅰ類包含2個基因（CaNRAMP1、CaNRAMP3），分別含有10、12個內含子，Ⅱ類包含3個基因（CaNRAMP2、CaNRAMP4、CaNRAMP5），均含有3個內含子。基于基因組織表達模式的分析結果表明，CaNRAMP1在不同組織中均未檢測到其表達;CaNRAMP5的表達集中在花器官，其余CaNRAMP基因均有不同的表達模式;通過逆轉錄定量PCR（qRT-PCR）分析發(fā)現，辣椒苗期中的葉片經過鎘處理后，CaNRAMP3基因呈明顯上調的趨勢，參與鎘脅迫反應的正向調控，其他基因則不參與鎘脅迫反應的調控。研究結果為進一步分析辣椒NRAMP基因家族的功能奠定了基礎。

關鍵詞：辣椒;NRAMP基因家族;生物信息學;基因表達

中圖分類號： S641.301? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）10-0069-06

辣椒（Capsicum annuum L.）為茄科辣椒屬一年或有限多年生草本植物。2016年我國辣椒的種植面積超過133.33萬hm2，占世界辣椒種植面積的35%，經濟總產值超過700億元，產值和效益位居蔬菜作物前列。NRAMP（natural resistance associated macrophage protein，天然抗性相關巨噬細胞蛋白）家族蛋白是一類廣泛存在于生物界、能轉運不同金屬離子的跨膜蛋白家族，它們對于調控和維持生物內金屬離子的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用。NRAMP家族蛋白采用質子共運輸方式，參與鐵離子（Fe2+）、錳離子（Mn2+）、鋅離子（Zn2+）、銅離子（Cu2+）、鎘離子（Cd2+）、鎳離子（Ni2+）、鈷離子（Co2+）、鋁離子（Al3+）、砷離子（As3+）等不同金屬離子的運輸[1-4]。NRAMP首先于哺乳動物巨噬菌細胞內被發(fā)現，因其能增加對胞內寄生物的敏感性而得名[5]。隨后，NRAMP同源基因被證實存在于細菌、酵母、藻類和動植物中[1]。研究發(fā)現，NRAMP在不同物種中高度保守，一般具有10～12個典型的跨膜結構域、1個胞質外轉運蛋白特征結構域[6]。

目前，研究者已經在擬南芥、水稻等植物中進行了NRAMP基因的克隆與功能鑒定，發(fā)現植物NRAMP家族蛋白基本定位于質膜和液泡膜上，主要在根、芽中表達，參與一些必需營養(yǎng)元素的轉運和調控[7]。擬南芥中的AtNRAMP1對植株從土壤中吸收Fe2+、Mn2+發(fā)揮著重要作用[8-9]。AtNRAMP3在低Fe2+環(huán)境下于植株維管束中表達，可能參與Fe2+的長途運輸[10]。AtNNRAMP3/4可以從擬南芥種子液泡中轉運Fe2+供幼苗在低Fe2+環(huán)境下萌發(fā)生長[11]。水稻OsNRAMP3通過調控植物體內和外界的Mn2+濃度，從而使植株正常生長[12]。此外研究也發(fā)現，NRAMP家族蛋白同樣參與有毒重金屬的吸收和轉運，在提高植物的抗性方面發(fā)揮著重要作用。擬南芥的AtNRAMP1/3/4在酵母中異源表達時具有轉運Fe2+、Mn2+、Cd2+的相關能力[11，13]。AtNRAMP6對Cd2+敏感并能調節(jié)Cd2+在擬南芥和酵母細胞內的分布[14]。水稻OsNRAMP1在擬南芥的木質部中表達時可以轉運和積累Cd2+、As2+[4，15-16]。OsNRAT1（OsNRAMP4的同源物）和OsNRAMP5分別是植株內Al3+和Mn2+、Cd2+的主要運輸載體[3，17]。另外，在一些特殊植物如超富集植物遏藍菜（Thlaspi caerulescens）中，發(fā)現TcNRAMP3/4在酵母中異源表達時都能轉運Fe2+、Mn2+、Cd2+，并且TcNRAMP 4大都具備轉運Zn2+的能力[18]，但是TcNRAMP3/4蛋白除了比擬南芥的同源蛋白AtNRAMP3/4的表達程度更高外，在功能上并無明顯區(qū)別。

2014年，Qin等對栽培辣椒品種遵辣1號及其野生祖先進行了基因組測序，從而為辣椒的分子生物學研究奠定了良好基礎[19]，但是關于辣椒中的NRAMP基因是否參與重金屬鎘的轉運卻鮮有報道。本研究利用生物信息學方法，對辣椒的NRAMP基因家族進行鑒定，并通過逆轉錄定量PCR（qRT-PCR）分析辣椒苗期葉片在鎘脅迫下相應基因家族的表達情況，以期為辣椒NRAMP基因的鎘運輸功能研究和耐性品種選育提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為辣椒Zunla-1號，由湖南省農業(yè)科學院蔬菜研究所提供。將辣椒種子消毒后進行催芽處理，種植于穴盤中，置于光照培養(yǎng)箱內，培養(yǎng)溫度周期為27 ℃—20 ℃，光—暗周期為14 h—10 h，在幼苗有4～6張真葉時，選擇長勢整齊的幼苗進行重金屬Cd2+脅迫處理（100 μmol/L），葉片樣品分別設置0、3、6、12、24 h 5個時間點進行處理，每次測試取7株樣品，設3次重復，取樣后立即放于液氮中速凍并置于 -80 ℃ 冰箱中待用。

1.2 辣椒NRAMP基因家族成員的鑒定與序列分析

辣椒全基因組數據從Zunla-1基因組數據庫（http：//peppersequence.genomics.cn）中獲得，利用Pfam數據庫中的NRAMP隱馬爾可夫模型搜索辣椒NRAMP家族蛋白。候選基因利用MEGA 6.0提供的Clustal W工具去除重復序列[20]，在Pfam網站（http：//pfam.xfam.org/search）上進行NRAMP結構域的鑒定。借助Expasy網站（http：//web.expasy.org/protparam/）獲得辣椒NRAMP蛋白序列相關信息，在ProtComp網站（http：//www.softberry.com）上分析相應蛋白的亞細胞定位，通過GSDS網站（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）獲得NRAMP基因的結構[21]。利用生物學軟件DNAMAN 8.0進行辣椒NRAMP結構域序列的多重比對，通過MEME網站（http：//meme-suite.org/tools/meme）進行基序（motif）分析，參數設計如下：基序長度為6～50個，保守基序最大為15;其他參數為默認值。

采取同源搜索法從NCBI（美國國立生物技術信息中心）官網（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）上下載擬南芥、水稻、大豆、苜蓿、番茄的NRAMP家族蛋白相關序列，借助工具MEGA 6.0，采用鄰接法構建相關系統(tǒng)進化樹，自舉（Bootstrap）檢測次數為1 000次，其他均為默認設置。從NCBI網站上下載辣椒遵辣一號（Zunla-1）的不同組織和果實發(fā)育各時期的轉錄組測序技術（RNA-seq）數據，利用Tophat、Cufflink軟件進行轉錄組表達的差異分析，運用R軟件繪制NRAMP基因的表達熱圖。

1.3 總RNA的提取和qRT-PCR分析

參考張亞利等的研究方法[22]，按照Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（北京博邁斯科技發(fā)展有限公司）的操作方法提取葉片總RNA，利用RNA逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司）反轉錄成cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTM IIMix（TaKaRa）試劑盒的操作方法進行qRT-PCR試驗，利用ABI 7000實時熒光定量PCR儀（ABI Prism，美國）檢測表達量。以β-actin為內參基因，利用DNAMAN 8軟件設計特異性引物。設3個技術重復，使用2-ΔΔCT法計算相對表達量[23]。

2 結果與分析

2.1 辣椒NRAMP基因家族的鑒定

通過生物信息學方法，從辣椒全基因組中得到8個候選基因，剔除不含有NRAMP典型結構域的蛋白，獲得5個辣椒NRAMP基因。根據基因在染色體上的排列順序，分別命名為CaNRAMP1～CaNRAMP5（表1），其中1個基因在染色體上的位置未知，在染色體2和染色體3上各有1個基因，在染色體4上有2個基因。辣椒NRAMP基因編碼蛋白質的長度范圍為468 aa（CaNRAMP1）～541aa（CaNRAMP4），分子量范圍為50.77 ku（CaNRAMP1）～58.95 ku（CaNRAMP4），等電點介于（CaNRAMP4）5.54～8.82（CaNRAMP3）之間。

2.2 辣椒NRAMP蛋白的結構域與保守基序分析

通過DNAMAN 6.0對辣椒CaNRAMP的蛋白成員進行序列比對。由圖1可以看出，CaNRAMP1與CaNRAMP3的序列相似性為50%，CaNRAMP2與CaNRAMP4、CaNRAMP5的序列相似性分別為69%、67%，說明CaNRAMP蛋白成員之間存在較高的保守性。

利用在線工具MEME進一步分析辣椒NRAMP蛋白的保守基序，在15個基序中，基序1、2、4、5、6、9出現在所有成員中（圖2）?；?位于TMD8、TMD9及胞質內轉運結構域（CTM）區(qū)，其CTM-GQSSTI（/M）TGTYAGQF（/Y）I（/V）MG（/Q）GFLD（/H/N）是最長基序和最大的嚴格保守區(qū)域;基序2位于TMD1、TMD2及其中的區(qū)域，包含TMD1的嚴格保守氨基酸殘基天冬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-天冬酰胺（Asp-Pro-Gly-Asn，簡稱DPGN）、甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸（Gly-Pro-Gly-Phe-Leu，簡稱GPGFL）;基序5位于TMD6及其中的區(qū)域，包含位于TMD6的嚴格保守氨基酸殘基脯氨酸-組氨酸-天冬酰胺（Pro-His-Asn，簡稱PHN）、絲氨酸-丙氨酸-亮氨酸-纈氨酸（Ser-Ala-Leu-Val，簡稱SALV）;基序4、6、9也相應地包含一些嚴格保守的氨基酸殘基?？傊?，上述結果說明，辣椒的NRAMP蛋白結構具有高度的保守性，其中嚴格保守殘基可能在NRAMP蛋白行使轉運金屬離子的功能中發(fā)揮重要作用。此外，辣椒CaNramp1丟失了部分基序，這可能導致相應基因成為假基因或者失去了轉運金屬離子的功能。

2.3 辣椒NRAMP基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

通過MEGA 6.0對辣椒與擬南芥AtNRAMP（6個）、水稻OsNRAMP（7個）、大豆GmNRAMP（8個）、苜蓿MtNRAMP（7個）、番茄LeNRAMP（3個）中已報道的NRAMP蛋白序列進行聚類分析。由圖3可以看出，6種植物的NRAMP基因家族成員可以分為2大類（Ⅰ和Ⅱ），分別包含2、3個辣椒相關基因。Ⅰ類中辣椒的CaNRAMP1與番茄的LeNRAMP1，Ⅱ類中辣椒的CaNRAMP2、CaNRAMP4分別與番茄的LeNRAMP3、LeNRAMP2為直系同源基因;大豆與苜蓿也有2對直系同源基因。由以上結果可知，同科植物間的NRAMP基因進化關系更近。而大豆（假多倍體植物）有4對旁系同源基因，說明大豆的NRAMP基因非常保守且擴張，可能是由染色體基因組的復制造成的[24]。另外，在植物NRAMP基因成員聚類中，Ⅰ類基因中一般含有10～12個內含子，Ⅱ類中一般含有3個內含子，這種高度相似的外顯子-內含子結構揭示了植物NRAMP基因家族的進化保守性;同時NRAMP基因在內含子數量或長度上都有不同的進化，表明Ⅰ類NRAMP基因在進化上更加復雜和具有多樣性，而Ⅱ類NRAMP基因更趨向于保守。

2.4 辣椒NRAMP基因家族的組織表達模式

為了分析辣椒NRAMP基因的表達模式，從NCBI中獲取Zunla-1不同組織（根、莖、葉、花蕾、花）及果實發(fā)育各時期的RNA-seq數據，結果未檢測到CaNRAMP1基因的表達信號。由圖4可以看出，CaNRAMP5在花蕾、花中具有中等豐度的表達，其余3個基因各有不同組織的表達模式。在不同組織中，CaNRAMP2的表達量在花蕾中最高，然后依次是根、花和莖中的表達量，在葉中的表達量相對最低;CaRAMP3的表達量在花中最高，其后依次是葉和根，在莖、花蕾中的表達量相對最低;CaNRAMP4的表達量在根中最高，其后依次是在莖、花蕾中的表達量，在花、葉中的表達量相對最低。此外，本研究結果顯示，CaNRAMP2、CaNRAMP3、CaNRAMP4全程參與果實發(fā)育階段的調控，其中CaNRAMP2、CaNRAMP4的表達量分別在綠熟果期、破色期最高，CaNRAMP3的表達量在綠熟果期最低，在破色期的表達量迅速上升到最高值，而CaNRAMP5僅在果實發(fā)育前期少量表達。

2.5 辣椒幼苗在鎘脅迫下NRAMP基因的表達分析

利用qRT-PCR分析辣椒葉片中NRAMP家族基因在100 μmol/L Cd2+處理后不同時間點的表達情況，結果未檢測到CaNRAMP1基因表達信號。由圖5可以看出，在Cd2+脅迫下，CaNRAMP2、CaNRAMP4基因在葉片中的相對表達量分別呈現緩慢上升、緩慢下降的表達趨勢，但在各個時間點間沒有明顯變化。CaNRAMP3基因在處理0～12 h呈明顯的上調趨勢，在處理12 h時表達量最高，為處理0 h時表達量的6.68倍;處理24 h時表達量有所減弱，但仍為處理0 h時表達量的3.26倍。CaNRAMP5基因在處理3～24 h的表達量整體呈下降趨勢，處理12 h時的表達量最低。結合基因組織表達熱圖可以看出，CaNRAMP3基因參與鎘脅迫反應的正調控，而CaNRAMP2、CaNRAMP4、CaNRAMP5基因不參與鎘脅迫反應的調控。

3 討論與結論

NRAMP家族蛋白是一類能在生物中轉運不同金屬離子的跨膜蛋白家族，在植物基本營養(yǎng)元素（Mn2+、Fe2+、Zn2+等）的吸收和抵御重金屬（Cd2+、Co2+、As2+等）毒害等方面發(fā)揮著重要作用。目前 人們已在擬南芥、水稻、大豆、苜蓿、番茄等植物中發(fā)現相關NRAMP家族蛋白，本研究也從辣椒中鑒定出5個NRAMP相關基因，根據系統(tǒng)進化關系，將6個植物中的NRAMP家族蛋白分為2大類。植物Ⅰ類NRAMP蛋白成員參與Fe2+、Mn2+、Cd2+等金屬離子的運輸。擬南芥AtNRAMP1、番茄LeNRAMP1、水稻OsNRAMP1、苜蓿MtNRAMP1分別在缺Fe2+環(huán)境下于各植物根部的表達量上調[8，25-26];部分水稻、擬南芥的NRAMP蛋白也參與到Mn2+、Cd2+的轉運和調節(jié)中[6，9，12，17]。而在植物Ⅱ類NRAMP蛋白成員中，也同樣具有部分金屬離子轉運的功能，AtNRAMP3、AtNRAMP4定位在擬南芥種子液泡中，參與Fe2+的運輸，在葉片中也參與Mn2+的轉運[11-12];部分大豆的NRAMP蛋白被預測定位在液泡上，發(fā)現具有轉運Mn2+、Cd2+、Cu2+的能力[27]。此外，在植物NRAMP蛋白成員中，Ⅰ類成員已被證實或預測定位于細胞質膜上，而Ⅱ類則被證實或存在于液泡膜上。這些研究結果表明，植物NRAMP同類成員之間可能有著相同的亞細胞定位，行使著類似的金屬離子轉運功能。

本研究對辣椒NRAMP基因的組織表達模式和qRT-PCR的分析結果顯示，均未檢測到CaNRAMP1基因的表達情況;CaNRAMP5的組織表達特異地集中于花蕾、花中，在葉中不表達，可能在花器官的發(fā)育過程中起重要作用;CaNRAMP2、CaNRAMP3、CaNRAMP4可能全程參與辣椒各生長發(fā)育階段的調控。在辣椒苗期葉中應對鎘脅迫處理時，CaNRAMP3基因的表達量有明顯上調趨勢，其余基因表達量皆無上調變化，說明CaNRAMP3參與鎘脅迫的正向調控，推測CaNRAMP3在葉中參與了Cd2+的轉運調控。CaNRAMP2、CaNRAMP4在根、莖中均有中較高的組織表達量，研究也發(fā)現，CaNRAMP2的直系同源基因LeNRAMP3在番茄根部可以轉運Fe2+、Cd2+[23，28]，CaNRAMP4的直系同源基因LeNRAMP2在番茄木質部可以轉運Zn2+[29]，預測這2個CaNRAMP基因在辣椒中可能具有類似的金屬離子轉運功能。

本研究通過生物信息學方法，在辣椒全基因組中鑒定了辣椒NRAMP基因家族，并對其序列結構、系統(tǒng)發(fā)育關系及表達情況進行了分析，對辣椒NRAMP基因成員在生長發(fā)育和Cd2+脅迫下的應答功能進行了初步預測。通過對辣椒NRAMP基因家族成員的全面了解，將有助于研究辣椒如何適應外界的鎘脅迫，可以為降低辣椒中鎘的積累量和優(yōu)化作物品質提供參考。

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