楊洪斌（重慶市第七中學(xué)校 重慶 400030）

在探討溫度對(duì)酶的影響時(shí)，教師經(jīng)常是根據(jù)教材中的“鐘型曲線”進(jìn)行講授，即在酶的最適溫度前，酶的活性隨溫度的升高而升高；在酶的最適溫度后，酶的活性隨溫度的升高而降低。因此，在生產(chǎn)或?qū)嶒?yàn)時(shí)要選擇酶的“最適溫度”作為反應(yīng)的“最佳溫度”。這種觀點(diǎn)幾乎根深蒂固地存在于所有教學(xué)和各種教輔資料中。其實(shí)，所謂酶的“最適溫度”并沒有“最適”的說法。

1 溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響原理

在影響酶活性的所有因素中，溫度對(duì)其的影響最具挑戰(zhàn)性。溫度幾乎影響生化反應(yīng)的各個(gè)方面，包括酶和底物的pH 依賴性、電離、金屬結(jié)合相互作用、酶構(gòu)象變化、蛋白質(zhì)的寡聚化、氫鍵、疏水相互作用及過渡態(tài)等。這些復(fù)雜的行為都與各種鍵相互作用及其與溫度相關(guān)的焓和熵變化有關(guān)。溫度對(duì)酶的影響主要表現(xiàn)在2 個(gè)方面：一是在一定溫度范圍內(nèi)保持酶自身的熱穩(wěn)定性或維持自身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；二是溫度會(huì)通過影響酶的活性位點(diǎn)的親和力影響酶的活性。一般情況下可通過以下方面增強(qiáng)酶對(duì)溫度的耐受性：1）選擇適宜的溶液pH 值；2）加入穩(wěn)定配體（例如底物、輔因子、金屬離子及調(diào)節(jié)效應(yīng)因子）；3）保護(hù)酶免受蛋白質(zhì)水解；4）其他蛋白質(zhì)（被稱為保護(hù)性膠體效應(yīng)的蛋白質(zhì)）的存在。由圖1［1］可知，在1～40℃內(nèi)，溫度每升高10℃，反應(yīng)速率就會(huì)增加一倍；但在高溫下，產(chǎn)物的形成速率迅速下降，且在達(dá)到平衡前酶的活性就消失了。

圖1 不同溫度下酶的產(chǎn)物的形成過程［1］

2 酶的穩(wěn)定性與催化原理

酶的“微觀穩(wěn)定性”與局部結(jié)構(gòu)可逆變化相關(guān)的能量有關(guān)。微觀穩(wěn)定性是造成酶活性位點(diǎn)的柔韌性或剛性的原因，這影響催化的底物或配體結(jié)合的位置［2］。酶的總體穩(wěn)定性是宏觀穩(wěn)定性與微觀穩(wěn)定性之間的自由能差異［3］。由于較弱的分子相互作用，酶的活性位點(diǎn)比整體酶更靈活，且酶的活性位點(diǎn)會(huì)比整體蛋白質(zhì)更快地失去其功能（加入化學(xué)變性劑或加熱后）變性［4］?！罢T導(dǎo)契合”模型假定酶活化是由于酶的活性位點(diǎn)與底物之間相互作用，進(jìn)而引起酶活性位點(diǎn)的構(gòu)象改變形成的?！安▌?dòng)契合”模型表明，酶的天然構(gòu)象在溶液中存在多種狀態(tài)，這些酶的不同構(gòu)象適用于不同溫度下酶能維持一定的功能。

3 平衡模型解釋溫度對(duì)酶活性的影響

酶活性對(duì)溫度的依賴性一般用“經(jīng)典模型”進(jìn)行描述，包含2 個(gè)過程：催化反應(yīng)（用kcat描述）和不可逆失活（由kinact定義）。這些溫度依賴性的速率常數(shù)分別通過催化活化能和熱失活反應(yīng)的活化能進(jìn)行表征。最近，很多科學(xué)家都發(fā)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)酶具有表觀最佳溫度。Thomas 和Scopes［5］的研 究表明，某些酶在高溫下的活性低于變性時(shí)所能解釋的活性。于是科學(xué)家提出了一個(gè)平衡模型。

其中酶活性形式（Eact）與非活性形式（Einact）處于平衡狀態(tài)，Einact是不活躍的形式。不可逆的熱失活到變性狀態(tài)（X）。平衡由平衡常數(shù)（Keq）描述?；诖?，可進(jìn)行如下轉(zhuǎn)換：

平衡用平衡時(shí)的焓（△Heq）和新的熱力學(xué)系數(shù)Teq進(jìn)行表征；Teq表示活性酶（Eact）和無活性酶（Einact）濃度相等時(shí)的溫度，因此，它相當(dāng)于熱力學(xué)平衡常數(shù)Km。通過繪圖，得到了圖2A［2］，成為了經(jīng)典模型；當(dāng)在A 圖的基礎(chǔ)上引入催化的活化能和不可逆反應(yīng)的活化能后，就得到了圖2B［2］這樣的平衡模型。這個(gè)類似于“帳篷”的模型已經(jīng)過了超過30 種酶的驗(yàn)證［6］，是一種可靠的速率-溫度-時(shí)間三維平衡模型。當(dāng)沒有發(fā)生變性時(shí)，所有表現(xiàn)出“帳篷”類型的酶的活性溫度在時(shí)間為零時(shí)表現(xiàn)最佳，而且研究表明Teq與穩(wěn)定性無關(guān)。

圖2 速率-時(shí)間-溫度平衡模型［2］

4 酶的最適溫度并不是“最適”的原理

4.1 酶活性的時(shí)間依賴性和溫度依賴性 平衡模型提出后，有很多研究者對(duì)該模型進(jìn)行了驗(yàn)證。Peterson 等［3］用芳基酰基酰胺酶做了一個(gè)酶的速率-時(shí)間-溫度曲線，由圖3A 可知，酶的最佳活性是一個(gè)不斷變化的量，它會(huì)隨著時(shí)間和溫度的變化而變化。在溫度為58.5℃時(shí)，由于Eact／Einact平衡而導(dǎo)致酶的活性非常快速損失達(dá)到了60%。在相同溫度下，變性導(dǎo)致酶的活性損失只在幾分鐘內(nèi)就完成了［6］。由圖3B［5］可知，在相同溫度下，酶的反應(yīng)速率會(huì)隨著反應(yīng)時(shí)間的變化而變化，也可以看出反應(yīng)時(shí)間越短，其活性越高，催化的速率就越快；同樣，在相同的時(shí)間內(nèi)，不同溫度下，酶的活性也不一樣［7］。無論是“帳篷”曲線還是用具體酶做實(shí)驗(yàn)，都能體現(xiàn)出酶的活性并沒有一個(gè)固定的最佳活性，它會(huì)隨時(shí)間和溫度的變化而變化，表現(xiàn)出對(duì)時(shí)間和溫度的依賴性。

圖3 酶的活性對(duì)時(shí)間和溫度的依賴［3，5］

4.2 酶的最適溫度與不可逆變性 由于酶的活性具有對(duì)時(shí)間和溫度的依賴性，因此，酶并沒有最適溫度。圖4A 是一個(gè)常見的圖［8］，也是高中生物學(xué)教材和練習(xí)題中常見的溫度對(duì)酶的催化速率影響的示意圖。在平時(shí)的教學(xué)中，教師會(huì)解釋在最適溫度之前，隨著溫度升高，酶的催化活性升高，因此，酶反應(yīng)速率會(huì)加快；超過最適溫度，酶的活性降低，酶反應(yīng)速率下降；過高的溫度會(huì)導(dǎo)致酶不可逆變性，這個(gè)“高溫”是全部酶都失活的溫度。由圖4A［8］可知，這種說法是不正確的。在“最適溫度”之前，酶的變性是一種可逆的變性；但是一旦超過了最適溫度，酶就開始變性，而且這種變性是一種不可逆的變性，所以“最適溫度”實(shí)際上是酶開始發(fā)生不可逆變性的溫度。因此，在實(shí)際的生產(chǎn)和應(yīng)用中，并不會(huì)選擇這樣一個(gè)“最適溫度”作為酶的反應(yīng)溫度。同時(shí)由圖4B［8］可知，溫度誘導(dǎo)的催化活化和溫度誘導(dǎo)的失活，取決于這2 個(gè)過程相應(yīng)的過渡態(tài)的能量。將溫度升高到可逆范圍內(nèi)會(huì)導(dǎo)致酶有更高的活性，降低溫度會(huì)使酶的活性恢復(fù)到其原始活性。當(dāng)發(fā)生不可逆變性時(shí)，冷卻至較低溫度則不會(huì)恢復(fù)催化活性，構(gòu)象的靈活性是許多酶在熱變性和不可逆的催化活性損失方面的弱點(diǎn)。

圖4 酶在不同溫度下的失活過程［8］

5 研究進(jìn)展

溫度對(duì)酶的影響非常復(fù)雜。溫度過高時(shí)，酶會(huì)發(fā)生不可逆變性；變性是一個(gè)復(fù)雜的化學(xué)過程，既要考慮到蛋白質(zhì)的大小和三維結(jié)構(gòu)，又要考慮溫度會(huì)影響酶在構(gòu)象變化之前或之后的化學(xué)反應(yīng)。目前，科學(xué)家還在研究不同溫度環(huán)境下生物體內(nèi)酶活性的變化，主要將酶分為冷適應(yīng)的酶和嗜熱酶。研究表明，冷適應(yīng)酶具有更靈活的活性位點(diǎn)［9］，其通過弱化酶活性位點(diǎn)中的分子內(nèi)力而產(chǎn)生；而嗜熱酶的活性位點(diǎn)則更加剛硬［10］。冷適應(yīng)酶和嗜熱酶的靈活性變化是由于活性位點(diǎn)的氨基酸結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的。冷適應(yīng)的微生物可以產(chǎn)生冷適應(yīng)的酶，它們能在比嗜溫生物更低的溫度下調(diào)節(jié)自身結(jié)構(gòu)進(jìn)行催化反應(yīng)。冷適應(yīng)酶在其最適溫度范圍內(nèi)的熱穩(wěn)定性范圍是有限的，因?yàn)樵诘蜏叵聵?gòu)象變化會(huì)隨溫度增加而增加，會(huì)導(dǎo)致酶活性位點(diǎn)的功能在蛋白質(zhì)的3D 結(jié)構(gòu)變性之前喪失，在其最適溫度下具有更剛性的活性位點(diǎn)［11］。嗜熱酶的活性位點(diǎn)的靈活性在其最適溫度下靈活性最大。總之，酶的靈活性和生物生活的環(huán)境密切相關(guān)，這可能是生物在進(jìn)化過程中對(duì)棲息環(huán)境的一種適應(yīng)。已有的研究表明，酶的活性具有時(shí)間和溫度的依賴性，因此，酶并沒有“最適溫度”。酶的活性是一個(gè)隨溫度和時(shí)間變化而變化的量，同時(shí)，平時(shí)所謂的“最適溫度”其實(shí)是酶發(fā)生不可逆變性的溫度。