馬宏偉，路廣計(jì)*，張若曦，劉天駒，李 翀，軒秋燕，劉志勇，范京惠,程麗華，邊青巖

(1.河北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北石家莊050035；2.唐山市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河北唐山063004；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北保定071001；4.饒陽(yáng)縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北衡水053900)

布魯氏菌病，簡(jiǎn)稱“布病”，是由布魯氏菌引起的一種以發(fā)熱、流產(chǎn)、睪丸炎、關(guān)節(jié)腫脹等臨床癥狀為特征的人畜共患傳染病，可侵害牛、羊、鹿、豬、狗、駱駝、水獺、海豹、海豚、鯨等多種動(dòng)物，也稱波浪熱、馬耳他熱、地中海熱，人間布病俗稱懶漢病、蔫吧病、千日病等，我國(guó)規(guī)定其為乙類傳染病[1-3]。布病流行廣泛且一年四季均可發(fā)病，通過(guò)消化道、呼吸道和皮膚黏膜在動(dòng)物、動(dòng)物和人之間傳播，對(duì)畜牧養(yǎng)殖和人類健康造成巨大危害，疫苗免疫和檢測(cè)篩查對(duì)于有效防控甚至凈化布病意義重大。目前，我國(guó)用于布病診斷的常規(guī)技術(shù)有血清學(xué)診斷、PCR 檢測(cè)和病原分離[4-5]。本研究對(duì)布病背景清晰的奶牛20 頭口服S2 疫苗免疫，采集樣品同時(shí)使用虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、間接ELISA（iELISA）、天然半抗原瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（NH-AGID）進(jìn)行檢測(cè)，其中iELISA 分別用血清、牛奶兩種樣品檢測(cè)，通過(guò)比較不同檢測(cè)方法的差異，探索免疫狀態(tài)下不同檢測(cè)方法的診斷意義，摸索鑒別人工免疫與自然感染的可行途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

某牛場(chǎng)泌乳牛，采用RBT、iELISA 和cELISA 3 種方法進(jìn)行布病抗體平行檢測(cè)，結(jié)果均為陽(yáng)性的作為假定布病感染牛（陽(yáng)性牛），結(jié)果均為陰性的作為假定健康牛（陰性牛），依據(jù)結(jié)果選擇陽(yáng)性牛、陰性牛各10 頭；布病疫苗S2（金宇保靈，160頭份/瓶，批號(hào)：18939003）；虎紅平板凝集抗原(中監(jiān)所，批號(hào)：20170810)；血清用iELISA（INGEZIM，批號(hào)：110917）；血清用競(jìng)爭(zhēng)ELISA（INGEZIM，批號(hào)：050318）；乳汁用 iELISA（INGEZIM，批號(hào)：100717）；天然半抗原免疫瓊擴(kuò)（INGEZIM，批號(hào)：020218）。以上檢測(cè)試劑按說(shuō)明書方法使用。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)牛每頭S2 疫苗口腔噴服2mL（按細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果稀釋到500 億活菌），陰、陽(yáng)性牛隔離分開飼養(yǎng)。首免當(dāng)天及免疫后30 天、60 天、90 天、120 天采集牛血、牛奶保存，血清用RBT、iELISA、NH-AGID 進(jìn)行檢測(cè)，牛奶用iELISA 進(jìn)行檢測(cè)。RBT 參照國(guó)標(biāo)動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)進(jìn)行，iELISA、NH-AGID 按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

測(cè)定布病抗體陽(yáng)性數(shù)、陽(yáng)性率、符合率，iELISA 檢測(cè)統(tǒng)計(jì)PP 值（PP 值=樣本OD 值/ 陽(yáng)性對(duì)照OD 值×100），對(duì)RBT、iELISA、NH-AGID結(jié)果用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

圖1.免疫后iELISA 抗體隨時(shí)間的變化

本試驗(yàn)將陰性牛作為假定健康牛、陽(yáng)性牛作為假定感染牛，在口服S2 疫苗后各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（如圖1），健康牛布病抗體持續(xù)了約3 個(gè)月時(shí)間，血清抗體在免疫后第15 天達(dá)到高峰并在60天內(nèi)維持高水平，第90 天時(shí)迅速下降，而感染牛因?yàn)橐岸镜脑蛟诿庖吆?0 天達(dá)到高峰，120 天時(shí)仍維持較高的抗體水平和抗體陽(yáng)性率（90%）。

2.1 不同方法血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

表1 健康牛不同血清學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果

表2 感染牛不同血清學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果

對(duì)2 組奶牛免疫后不同階段的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表1、表2。健康組免疫后30、60、90、120 天iELISA 檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)分別為8、8、1、0，RBT、AGID-LPS、AGID-NH檢測(cè)持續(xù)為陰性。RBT、AGID 與iELISA 免疫后不同階段檢測(cè)結(jié)果符合率為20%、20%、90%、100%。感染組免疫后30、60、90、120 天RBT、AGID-LPS、iELISA 檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)為10、10、9、9，RBT、AGID-LPS 與iELISA 免疫后各階段檢測(cè)結(jié)果符合率均為100% ；AGID-NH 檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)為10、10、6、6，與iELISA免疫后各階段檢測(cè)結(jié)果符合率分別為100%、100%、70%、70%。

2.2 不同樣品iELISA 檢測(cè)結(jié)果

本次試驗(yàn)采集了血清和牛奶兩種樣品進(jìn)行iELISA 檢測(cè)，結(jié)果見表3、表4。健康牛免疫后30、60、90、120 天牛奶樣品檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)為8、6、4、0，與血清檢測(cè)結(jié)果符合率為100%、80%、70%、100%；感染牛免疫各階段牛奶樣品檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)為10、10、9、9，與血清檢測(cè)結(jié)果符合率為100%。

表3 健康牛血清與牛奶檢測(cè)結(jié)果

表4 感染牛血清與牛奶檢測(cè)結(jié)果

2.3 不同方法結(jié)果一致性檢驗(yàn)

由上述各表可知，健康牛組RBT 與AGID 檢測(cè)結(jié)果完全一致，與血清iELISA 結(jié)果差異極大；而牛奶iELISA 與血清iELISA 隨免疫階段陽(yáng)性率逐漸下降。對(duì)免疫后30、60、90 天健康牛血清與牛奶的iELSIA 檢測(cè)結(jié)果用Kappa 法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中30 天的Kappa 值為1，P=0.002，說(shuō)明iELSIA- 血清與iELSIA- 牛奶結(jié)果完全一致；60天的Kappa 值為0.545（95%CI：0.043～1.000），P=0.053，說(shuō)明二者間一致性程度中等；90 天的Kappa 值為0.286（95%CI：-0.186～0.758），P=0.197，說(shuō)明二者間一致性程度一般。

感染牛組RBT、血清iELISA、牛奶iELISA、AGID-LPS 檢測(cè)結(jié)果完全一致，與AGID-NH 檢測(cè)結(jié)果有一定差異。用SPSS 22.0 軟件對(duì)感染牛免疫后90、120 天血清iELSIA 與AGID 的檢測(cè)結(jié)果用Kappa 法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Kappa 值為0.286（95%CI：-0.186～0.758），P=0.197，表 明iELSIA與AGID 結(jié)果之間的一致性一般。

3 討論

布魯氏菌病是奶牛飼養(yǎng)中必須防控的一種重要人畜共患病，能否準(zhǔn)確、快速診斷出群體中的感染牛是預(yù)防和控制布病的關(guān)鍵。目前基層診斷采用的RBT、SAT 等血清學(xué)方法因存在著不同程度的缺陷導(dǎo)致一定比例的誤診和漏檢。

RBT 抗原為酸化帶色抗原（pH 3.6～3.8），因可抑制待檢血清中IgM 凝集活性，檢測(cè)的抗體主要為IgG。RBT 因敏感性、操作性及成本低等特點(diǎn)在基層廣泛使用，但也易受干擾而影響結(jié)果，如：樣本溶血、緩沖液pH 值、試驗(yàn)溫度、反應(yīng)超時(shí)、交叉反應(yīng)等。本次試驗(yàn)健康牛免疫后RBT 一直未檢測(cè)到抗體，原因可能是疫苗抗原刺激產(chǎn)生的血清抗體滴度較低，未能達(dá)到RBT 檢測(cè)的閾值。在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中野生布魯氏菌抗原刺激強(qiáng)于疫苗株，或疫苗幾乎不進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)而直接稀釋免疫，抗原刺激強(qiáng)度遠(yuǎn)高于試驗(yàn)，因此在基層檢測(cè)中本方法?？蓹z測(cè)到布病抗體[6-8]。

ELISA 是OIE 規(guī)定國(guó)際貿(mào)易中布病檢測(cè)指定試驗(yàn)方法之一[9]，因具有高敏感、高通量、結(jié)果判定無(wú)人員干擾的特點(diǎn)而逐漸在基層檢測(cè)中應(yīng)用。本試驗(yàn)比較了不同樣品iELISA 法差異性，從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，兩種iELISA 檢測(cè)一致性程度隨免疫時(shí)間增加而逐漸降低，kappa 值在0.286～1.000（60 天內(nèi)0.545～1.000 之間）；牛奶與血清布病抗體消長(zhǎng)規(guī)律基本一致，且牛奶布病抗體下降趨勢(shì)略緩于血清。綜合樣品采集便利性、對(duì)動(dòng)物應(yīng)激影響等因素，對(duì)泌乳牛布病免疫效果評(píng)價(jià)，可考慮使用牛奶樣品代替血清進(jìn)行檢測(cè)。但由于iELISA 包被抗原為光滑型布魯氏菌菌體表面的脂多糖（LPS），我國(guó)布病弱毒疫苗菌株均為光滑型且其LPS 無(wú)特異性特征，因此，iELISA 檢測(cè)結(jié)果無(wú)法區(qū)分抗體是源于疫苗注射還是自然感染[1,10]。

NH-AGID 是本試驗(yàn)引入的一種鑒別診斷方法，其包被抗原分為脂多糖（LPS）和半抗原多糖（Native Hapten,NH）兩種，二者均存在于細(xì)菌細(xì)胞膜中，但NH 缺少3- 脫氧-D- 甘露糖-2 辛酮糖酸（KDO）這類LPS 免疫核心位點(diǎn)，免疫原性較低[11]。國(guó)外研究資料顯示，NH 與分離自粗糙型布魯氏菌的polyB 類似，且IgG1 與NH 的反應(yīng)性更好；NH 與光滑型布氏菌LPS 的O 鏈通過(guò)非共價(jià)鍵作用錨定與細(xì)菌表面，在高滲條件下S19、Rev1疫苗免疫動(dòng)物血清中檢測(cè)不到NH 抗體，而感染動(dòng)物血清中可檢測(cè)到[12-14]。NH 這一特性使其在大量接種疫苗與受感染動(dòng)物共存的復(fù)雜背景下最能確認(rèn)出真正感染的動(dòng)物[15]。根據(jù)試劑說(shuō)明，NH-AGID 中出現(xiàn)NH、LPS 兩條沉淀帶為布病感染動(dòng)物，出現(xiàn)LPS 一條沉淀帶為免疫動(dòng)物。試驗(yàn)檢測(cè)期內(nèi)健康牛血清NH、LPS 條帶均未出現(xiàn)，表明該組奶牛未感染野毒，但因S2 免疫抗體滴度較低，未達(dá)到本方法檢測(cè)閾值，也為檢測(cè)出免疫抗體。感染牛血清NH、LPS 雙條帶率在免疫2 個(gè)月內(nèi)為100%，此后隨免疫時(shí)間逐漸降低，120 天時(shí)仍有60%為雙條帶。試驗(yàn)中一頭奶牛在免疫后90 天雙條帶轉(zhuǎn)陰，對(duì)應(yīng)RBT、血清iELISA、牛奶iELISA 檢測(cè)結(jié)果也均為陰性，這是由于布病疫苗免疫后部分感染奶牛短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)轉(zhuǎn)陰現(xiàn)象所致。楊珍等對(duì)S2 免疫羊群進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，NH-GD敏感性約75.4%，并指出方法敏感性高低與布魯氏菌產(chǎn)生的抗原刺激強(qiáng)弱有關(guān)，無(wú)NH 沉淀帶不一定是布病陰性動(dòng)物[16]。本試驗(yàn)中AGID 敏感性總體平均值為80%（60%～100%），特異性100%，與RBT、iELISA 相比在鑒別診斷上有較大優(yōu)勢(shì)，可在免疫早期即能區(qū)分人工免疫與野毒感染，為牛群布病凈化防控爭(zhēng)取到更多的時(shí)間機(jī)會(huì)。因NH-AGID 敏感性較低、且考慮到該方法檢測(cè)通量小，建議在對(duì)奶牛群布魯氏菌病篩查和凈化時(shí)，使用敏感性高的方法，如：iELISA、RBT 等進(jìn)行初篩，陽(yáng)性結(jié)果用NH-AGID 進(jìn)行復(fù)核。