郭 亮，李曉鐵，秦麗鳳

(1.桂林市林業(yè)科學(xué)研究所，廣西 桂林 541004；2.桂林林業(yè)學(xué)校，廣西 桂林 541004)

青錢柳(Cyclocaryapaliurus)又名青錢李，搖錢樹等，為胡桃科青錢柳屬植物，該屬僅包含青錢柳一個品種，是國家Ⅱ級重點保護瀕危植物，同時也是冰川四世紀保存下來的珍稀樹種，產(chǎn)地主要分布于我國湖南、安徽、江蘇、浙江、江西、福建、臺灣、湖北、四川、貴州、廣西、廣東和云南南部[1]。桂北地區(qū)屬亞熱帶濕潤季風氣候，氣候溫和，雨量充沛，因此較為適合青錢柳生長。

青錢柳不僅是優(yōu)良的造林樹種和綠化樹種，其活性成分還具有豐富的藥用價值。近年來隨著對青錢柳研究的深入，發(fā)現(xiàn)葉片中其含有可溶性多糖、黃酮、皂甙等活性成分。在可溶性多糖研究方面，2001年李磊等利用超聲波萃取手段，從青錢柳葉片中提取了1種多糖復(fù)合物，并通過試驗證明該種多糖復(fù)合物具有降血糖的功效[2]；2006年鄧小云等利用小鼠慢性皮下腫芽試驗，證明多糖物質(zhì)具有消炎和抗凝血作用[3]。在黃酮類化合物研究方面，2007年蔡文偉等發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有抗癌和抗腫瘤的功效[4]；2003年曹緯國等究研證明黃酮類化合物在治療心腦血管疾病、抗病毒和增強機體免疫系統(tǒng)功效方面具有積極作用[5]。皂甙類化合物具有多種重要的生物活性和廣泛的藥理作用，例如抗過敏、消炎、抗病毒、治療白血病等[6]。

青錢柳葉片中活性成分含量隨采摘樹齡和采摘時間具有一定的變化規(guī)律，本次探究旨在利用對比試驗和方差分析法，探究不同采摘樹齡和采摘時間下，各組分含量的差異，尋找較為適合的采摘樹齡和采摘時間，提高青錢柳葉片的利用率，同時選出優(yōu)良的無性系家系，為后期探究應(yīng)用生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

1 實驗材料及方法的選取

1.1 供試樣品及采集地概況

采集地點為桂北地區(qū)，采集樣品為桂林市花坪保護區(qū)本地無性系家系，桂北地區(qū)屬亞熱帶濕潤季風氣候，氣候溫和，雨量充沛，平均海拔150 m左右，全年無霜期300 d左右，平均氣溫19 ℃，年平均降雨量 1 900 mm，是我國的青錢柳主產(chǎn)區(qū)之一(見表1)。

1.2 實驗儀器及材料

1.2.1 實驗材料

葡萄糖(對照品，Sigma公司)，苯酚(AR，國藥集團)，濃硫酸(AR，廠家)，青錢柳葉片(廣西桂林)，石油醚(60～90，AR，國藥集團)，無水乙醇(AR，廣東光華)，蘆丁標準品(標準品，國藥集團)，香草醛，冰醋酸，甲醇，正丁醇，人參皂苷(標準品，國藥集團)。

表1 樣品采摘時間、地點及采摘樹齡

Tab.1 Sample picking time, place and tree age

樣品編號Sample number采摘時間Picking time采摘地點Picking place采摘樹齡/aPicking age/a12017年8月9日桂林市林業(yè)科學(xué)研究所222017年8月9日桂林市林業(yè)科學(xué)研究所332017年8月9日桂林市靈川縣大圩鎮(zhèn)442017年8月9日桂林市靈川縣靈田鎮(zhèn)1052017年11月13日桂林市林業(yè)科學(xué)研究所262017年11月13日桂林市林業(yè)科學(xué)研究所372017年11月13日桂林市靈川縣大圩鎮(zhèn)482017年11月13日桂林市靈川縣靈田鎮(zhèn)1092018年4月12日桂林市林業(yè)科學(xué)研究所2102018年4月12日桂林市林業(yè)科學(xué)研究所3112018年4月12日桂林市靈川縣大圩鎮(zhèn)4122018年4月12日桂林市靈川縣靈田鎮(zhèn)10

1.2.2 實驗儀器

分光光度計(UV-1800，島津)，索氏提取器，移液槍(20～200 μL、100～1000 μL、500～5000 μL，德國赫施曼)。

1.3 實驗方法

1.3.1 青錢柳葉片中可溶性多糖的提取及測定方法

青錢柳葉片經(jīng)過除雜、干燥、粉碎后，用多功能提取器在60 ℃下石油醚脫脂脫色3 h ，濾去石油醚，室溫晾干后作為提取原料。

用葡萄糖配成50 μg·mL-1的標準溶液。準確移取200 μL、400 μL、600 μL、800 μL、1 000 μL 標準溶液于各試管中，制作標準曲線。

預(yù)處理后的青錢柳葉片經(jīng)水提、過濾后定容到相應(yīng)體積，取1 mL 濾液加入3 mL 無水乙醇，溶液在 8 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心10 min，棄去上層清液得到沉淀，用蒸餾水溶解沉淀，準確吸取該溶液50 μL，試管加入500 μL 5%苯酚溶液，混勻后快速加入4.0 mL濃硫酸，振蕩混勻80℃水浴20 min進行顯色，在490 nm 下測定其吸光值，根據(jù)所得回歸曲線方程計算多糖含量，按以下公式計算多糖得率:青錢柳葉多糖得率= 濾液中多糖的質(zhì)量/ 青錢柳葉質(zhì)量×100 %。

1.3.2 青錢柳葉片中總黃酮的提取及含量測定方法

用蘆丁對照品準確配制0.147 mg·mL-1標準溶液，移取0.0 mL，0.5 mL，1.0 mL，1.5 mL，2.0 mL，2.5 mL于6只10 mL具塞試管中，加入1 mL 1%的三氯化鋁/甲醇溶液，用甲醇定容，搖勻，放置15 min，制作蘆丁標準曲線。

精密稱取5 g，精確到0.0001 g，加入30 mL甲醇回流4 h，過濾，提取3次，合并，定容至100 mL，取50 μL，具塞試管中，加入1 mL 1%的三氯化鋁/甲醇溶液，用甲醇定容，搖勻，放置15 min，于410 nm 波長下測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算青錢柳總黃酮的含量。

1.3.3 青錢柳葉片中總皂苷的提取及含量測定方法

精密稱取人參皂苷16.6 mg，定容至10mL，吸取人參皂苷Re標準溶液0 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL、100 μL，分別置于具塞試管中，于水浴中揮盡溶劑，冷卻，再加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2mL和硫酸磺1.0 mL，繪制標準曲線。

精密稱取青錢柳葉片10g，置于250 mL燒瓶中，加乙醚40 mL，水浴回流2h，揮去乙醚的脫脂樣品，再用70%的乙醇溶液30 mL回流至流液無色，乙醚提取液置蒸發(fā)皿中，在水浴上濃縮至干，殘渣加水10mL使溶解。用50 mL水飽和的正丁醇萃取，重復(fù)萃取4次，合并正丁醇萃取液，用20 mL正丁醇飽合水洗滌。正丁醇溶液轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)皿中，在水浴上濃縮至干，用甲醇溶解殘渣并將其轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得供試液。

吸取20 μL供試液置于具塞試管中，按“標準曲線繪制”項下的操作測定吸光度，在標準曲線上查出相應(yīng)的總皂甙含量。

1.4 數(shù)據(jù)的處理

每種樣品取3株，混合均勻后進行有效成分提取，檢測的結(jié)果利用SPSS軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗結(jié)果

將采集的樣品送至廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院利用紫外分光光度法進行檢測，檢測結(jié)果如表2所示。

表2 各成分含量檢測結(jié)果

Tab.2 Test results of each component content

12組樣品中可溶性多糖含量最高的為樣品3(可溶性多糖含量為14.69 mg·g-1)，最低的為樣品12(可溶性多糖含量為10.99 mg·g-1)；樣品5組合檢測到的總黃酮含量最高，為40.33 mg·g-1；樣品12總黃酮含量最低，為25.01 mg·g-1；樣品5的總皂苷含量最高，為23.15 mg·g-1，最低為樣品12，含量為15.02 mg·g-1。

2.2 結(jié)果分析

利用spss軟件進行方差分析，檢驗采摘時間和采摘樹齡對各成分含量影響的顯著程度，結(jié)果如表3：可溶性多糖中采摘時間的F=2.557，P=0.157>0.05，差異不顯著，說明不同采摘時間對青錢柳葉片中可溶性多糖含量的影響并不顯著，采摘樹齡的F=15.935，P=0.003<0.01，差異極顯著，說明不同采摘樹齡對青錢柳葉片中可溶性多糖含量的影響極其顯著；總黃酮中采摘時間的F=68 771.677，P=0.000<0.01，說明采摘時間對總黃酮含量具有極顯著的影響；采摘樹齡的F=165.780，P=0.000<0.01，說明采摘樹齡對總黃酮含量同樣具有極顯著的影響；總皂苷中采摘時間的F=18.613，P=0.003<0.01，采摘樹齡的F=48.464，P=0.000<0.01，說明采摘時間和采摘樹齡對青錢柳葉片中總皂苷的含量都有極顯著的影響。在方差分析中表現(xiàn)為影響顯著和影響極顯著的成分都需要進行進一步的多重比較分析(見表3)。

表3 采摘樹齡和采摘時間對各成分含量影響的方差分析

Tab.3 Variance analysis of the effect of picking age and time on the content of components

表4為采摘時間的多重比較結(jié)果，從中可見，總黃酮在α=0.05顯著水平下，3個采摘時間都在不同列，說明3個采摘時間之間存在顯著差異，最高為2017年11月13日；總皂苷在α=0.05顯著水平下3個采摘時間分布在不同列，證明這3個采摘時間兩兩之間同樣具有顯著差異，且2017年11月13日采摘的總皂苷含量最高。

表4 不同采摘時間的多重比較(SNK法，α=0.05)

Tab.4 Multiple comparison between different picking time(SNK, α=0.05)

表5為不同采摘樹齡間的多重比較結(jié)果，從中可見，可溶性多糖在α=0.05顯著水平下，樹齡3年、4年、10年不在同一列，3個水平間存在顯著差異；兩年分別與3年和10年在同一列，說明之間沒有顯著差異；兩年和4年不在同一列，存在顯著差異，最高為4年；總黃酮中4個采摘樹齡同樣不在同列，說明四個采摘樹齡之間同樣存在顯著差異，最高為兩年；總皂苷中4個采摘樹齡同樣分布在不同列，證明這4個采摘樹齡兩兩之間同樣具有顯著差異，且樹齡為兩年時采摘的總皂苷含量最高。

表5 不同采摘樹齡的多重比較(SNK法，α=0.05)

Tab.5 Multiple comparison between different picking age(SNK, α=0.05)

3 結(jié)論與討論

本次探究利用方差分析和各個水平間的多重比較，發(fā)現(xiàn)青錢柳葉片采摘時間和采摘時的樹齡，對可溶性多糖含量，總黃酮含量，總皂苷含量會有一定影響。其中采摘樹齡對可溶性多糖含量影響分析中F=15.935，P=0.003<0.01，表現(xiàn)的差異極顯著，而采摘時間對可溶性多糖含量影響分析中F=2.557，P=0.157>0.05，差異不顯著，因此樹齡達到4年時，可溶性多糖含量較多，如果想提取更多可溶性多糖，建議選擇4年生青錢柳葉片進行采集；采摘時間和采摘樹齡分別對總黃酮含量影響分析中P=0.000<0.01，表現(xiàn)為影響極其顯著，采摘時間和采摘樹齡分別對總皂苷含量影響分析中P值分別為0.003和0.000，均小于0.01，同樣表現(xiàn)為影響極其顯著，因此當采摘時間在11月中旬，采摘樹齡為兩年時，青錢柳葉片中的總黃酮含量和總皂苷含量較高，如果想獲得更多的皂苷和黃酮，應(yīng)選擇兩年生的青錢柳并在每年的11月中旬進行采集。此外探究所選取的桂林市花坪保護區(qū)本地無性系家系在可溶性多糖含量、黃酮含量、皂苷含量方面都具有較高的水平，具有很高的培養(yǎng)價值。

提高青錢柳葉片中活性成分的利用率，一方面是要選擇各組分含量較高的時期進行采摘，另一方面是需要更為合理高效的提取方法，本次探究主要側(cè)重于總結(jié)各組分的采摘時間，而在提取方法方面，主要采用的是前人較為常見的方法，提取率仍有提高的空間，在今后的探究工作中，將著手探索更為高效便捷的青錢柳活性成分提取方法。