肖開興，肖析蒙,楊瑤君，易志飛，唐 雪

(1.樂山師范學(xué)院 竹類病蟲防控與資源開發(fā)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，樂山 614000；2.樂山師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，樂山 614000；3.西華大學(xué)， 食品與生物工程學(xué)院，成都 610039)

農(nóng)藥化肥對茶樹品質(zhì)造成嚴(yán)重破壞，急需要生態(tài)環(huán)保的新技術(shù)。近年來，微生物菌肥對植物的促生、抗病等領(lǐng)域的研究速度迅猛，已發(fā)現(xiàn)其對谷類和豆科等植物的增產(chǎn)、增收效果顯著[1]，根際促生菌有助于增加植物鹽脅迫能力，增強(qiáng)植株耐受性[2]，為滿足農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需要，使用菌肥代替部分化肥已經(jīng)受到了研究人員的關(guān)注[3],復(fù)合微生物肥是一種經(jīng)過特殊的加工工藝制成的、含有活菌的生物肥料，可通過解磷、固氮、解鉀來提升土壤中營養(yǎng)元素的效果[4],在本實(shí)驗(yàn)中，以植株的生長狀態(tài)，葉片中茶多酚、葉綠素的含量，土壤中氮磷鉀的含量作為體現(xiàn)復(fù)合微生物肥促生、抗病效果的主要檢測指標(biāo)。

茶葉源自中國，早期是作為祭品使用，茶葉飲品也被譽(yù)為“世界三大飲品之一”，茶多酚(tea polyphenols, TPs)是茶葉中多類物質(zhì)的總稱。研究表明，飲茶對人體健康具有重要的保護(hù)作用，且其藥理作用和安全性已經(jīng)得到證實(shí)[5～6]

葉綠素(chlorophyll)是植物光合作用最重要的色素之一,也是評價(jià)葉片光合能力的主要指標(biāo)之一[7]，植物先通過葉綠素利用光能來進(jìn)行光合作用從而為植物提供營養(yǎng)，經(jīng)研究表明，對植物使用菌肥后植株葉片中葉綠素含量的提高[8]。

土壤中的營養(yǎng)元素的存在狀態(tài)對植物來說至關(guān)重要，其含量也是影響植物生長發(fā)育的重要條件，氮、磷、鉀作為大量元素，對植物的生長尤為重要，本實(shí)驗(yàn)分析了復(fù)合微生物肥對茶樹土壤中的銨態(tài)氮、速效磷、有效鉀的影響，以期研究復(fù)合微生物肥對增加茶葉產(chǎn)量和改善茶葉品質(zhì)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

1.1.1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1.1.1 茶樹株高測試材料 該實(shí)驗(yàn)所有測試項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)材料由樂山市夾江縣迎江鄉(xiāng)郭坪村(經(jīng)度：103.50緯度：29.78)茶樹種植基地提供，測量初次選取長勢大致相同的植株，共測試樣品60株，其中1～30號樣品為處理組(生長期間施加復(fù)合微生物肥)； 31～60號樣品為對照組(生長期間施加普通化肥)，處理組用地和對照組用地之間相隔7 m，處于同一水平面上，初次測量時(shí)間為2018年3月，二次測量時(shí)間為2018年12月。

1.1.1.1.2 茶多酚測試材料 在以下3個(gè)測試項(xiàng)目中，實(shí)驗(yàn)材料的選取與上述茶樹株高測試材料選取的地區(qū)一致，海拔相同，茶樹長勢以及前期施肥情況相同。本項(xiàng)目測試樣品共30組，其中1～15號樣品為處理組(生長期間施加復(fù)合微生物肥)；16～30號樣品為對照組(生長期間施加普通化肥)。茶葉樣品的采制參考《茶樹種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[9]。2019年1月12—15日進(jìn)行樣品茶多酚含量測定[10]。

1.1.1.1.3 葉綠素測試材料 該項(xiàng)目共測試樣品30組，其中1～15號樣品為處理組(生長期間施加復(fù)合微生物肥)；16～30號樣品為對照組(生長期間施加普通化肥)。樣品在采制時(shí)選取頂部成熟葉片，避免采摘的葉片出現(xiàn)破損、蟲病等情況，采摘的大小要求基本一致2019年1月21—24日進(jìn)行樣品葉綠素含量測定[11]。

1.1.1.1.4 土壤中主要營養(yǎng)元素測量材料 該項(xiàng)目共測試樣品30組，其中1～15號樣品為處理組(生長期間施加復(fù)合微生物肥)；16～30號樣品為對照組(生長期間施加普通化肥)。選取植株根系附近土壤作為實(shí)驗(yàn)樣品，為避免土壤物質(zhì)理化性質(zhì)遭到破壞，將樣品于通風(fēng)處自然風(fēng)干約10 d，所得干燥樣品便于實(shí)驗(yàn)后續(xù)操作。

1.1.1.2 化學(xué)試劑 茶多酚純品、酒石酸鉀鈉、氯化亞鐵、丙酮、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉(以上試劑均為AR級)、土壤養(yǎng)分測定相關(guān)試劑(由托普云農(nóng)科技股份有限公司提供)。

復(fù)合微生物肥 由四川鑫鑫驕揚(yáng)生物科技有限公司提供，產(chǎn)品含枯草芽孢桿菌等有效菌5億CFU/克，有機(jī)質(zhì)70%，蓄水倍數(shù)60倍。

酒石酸亞鐵溶液 準(zhǔn)確稱取硫酸亞鐵樣品1g，酒石酸鉀鈉樣品5 g，加水溶解后定容至1L(可加少量鐵粉防止配置好的溶液發(fā)生氧化)。

pH7.5磷酸緩沖溶液 準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鉀9.08 g(經(jīng)過100 ℃、2.5h烘干處理)，加水溶解后定容至1L;準(zhǔn)確稱取磷酸氫二鈉23.9 g，加水溶解后定容至1L,需用時(shí)取上述兩種溶液按照KH2PO4∶Na2HPO4=17∶3的比例均勻混合使用。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

分光光度計(jì)、土壤測定儀(本項(xiàng)目測定使用土壤測定儀由托普云農(nóng)科技股份有限公司研發(fā))、搖床、烘箱、水浴鍋、電子天平。

1.2 方法

1.2.1株高測量方法

測量植株基部至主莖頂部記為主莖生長點(diǎn)之間的距離。根據(jù)實(shí)際情況，本實(shí)驗(yàn)采用軟皮尺進(jìn)行數(shù)據(jù)測量。

1.2.2 葉片樣品處理方法

樣品采集后，將樣品放至0 ℃冰箱保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)，取大小大致相同葉片，在其同一部位，避開比較粗大的葉脈，選取約1 cm2,均勻切成1 mm寬、5 mm長的細(xì)絲狀，切成20份。

1.2.3 土壤樣品處理方法

將土壤放置于通風(fēng)口，均勻鋪在干凈的紙板上，風(fēng)干10 d，待風(fēng)干后，將樣品碾磨處理，過80目篩，去除土壤中植物根莖等雜質(zhì)。收集處理好的樣品(完成每項(xiàng)測量指標(biāo)需處理好的土壤樣品4～5 g)。

1.2.4 樣品中茶多酚的檢測

1.2.4.1 制作茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線 茶多酚類的物質(zhì)能夠和亞鐵離子結(jié)合，形成藍(lán)色的絡(luò)合物，并且在一定波長有最大的吸收度，茶多酚在溶液中的含量與形成的絡(luò)合物的吸光度在一定范圍內(nèi)成正比，因此可用分光光度法測量茶多酚在溶液中的含量。本實(shí)驗(yàn)需準(zhǔn)確稱取0.5 g茶多酚純品，用水定容至100 mL，用移液槍量取0.00 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL，加水至10 mL,再向其加入酒石酸亞鐵溶液5 mL[12]，混合均勻加入磷酸緩沖液至刻度，搖勻，靜置10 min。在550 nm處用空白溶液作為參比，測定其吸光度，從而繪制茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2 樣品中茶多酚含量的測定 每組取茶葉樣品0.5 g倒入裝有20 mL水的玻璃管中，放置于水浴鍋中，水浴溫度為60 ℃，浸提時(shí)間為120 min[13]。水浴完成后，用移液槍吸取茶葉樣品浸提液2 mL，同時(shí)，加入配制好的酒石酸亞鐵溶液5 mL，再加入蒸餾水8 mL，搖勻，加入磷酸緩沖液至容量瓶刻度線，搖勻，靜置10 min。在550 nm處用空白溶液作為參比，測定其吸光度，根據(jù)繪制好的茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)計(jì)算得出樣品中的茶多酚濃度。

圖1 茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.5 樣品中葉綠素含量的測定

1949年經(jīng)Arnon解釋和推導(dǎo)以來[14],丙酮法作為Arnon法在國際上被廣泛應(yīng)用至今[15]。將處理好的葉片樣品倒入20 mL、80%丙酮溶液中，在黑暗條件下提取24 h。根據(jù)Lambert-Beer定律，在645 nm和663 nm處用80%丙酮溶液作為參比，測定其吸光度，根據(jù)以下公式計(jì)算得出樣品中葉綠素的含量：

C=Ca+Cb=8.04A663+20.29A645[16]

(1)

1.2.6 土壤樣品中銨態(tài)氮、速效磷、有效鉀含量的測定

本項(xiàng)目測定使用托普云農(nóng)科技股份有限公司研發(fā)的土壤養(yǎng)分測試儀。

1.2.6.1 銨態(tài)氮含量的測定 每組準(zhǔn)確稱取土壤樣品4 g，放入容量為100 mL三角瓶中，加入20 mL蒸餾水以及1號粉末1 g，在搖床中搖勻10 min，160 r·min-1，過濾，所得濾液用移液槍吸取 1 000μL于比色皿中，此為待測液；用移液槍吸取900 μL蒸餾水，再加入100 μL氮標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，所得溶液為標(biāo)準(zhǔn)液；用移液槍吸取2 mL蒸餾水于比色皿中，此為空白液。向標(biāo)準(zhǔn)液和待測液中各加入100 μL氮1號試劑，混勻，再加入100 μL氮2號試劑，混勻。停放20 min,再加入800 μL蒸餾水，立即上機(jī)操作，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.6.2 速效磷含量的測定 每組準(zhǔn)確稱取土壤樣品4 g，放入容量為100 mL三角瓶中，加入20 mL蒸餾水以及2號粉末0.5 g(用精確pH試紙測定土壤為弱堿性)，在搖床中搖勻10 min，160 r·min-1，過濾，所得濾液用移液槍吸取200 μL于比色皿中，再加入800 μL蒸餾水，此為待測液；用移液槍吸取900 μL蒸餾水，再加入100 μL磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，所得溶液為標(biāo)準(zhǔn)液；用移液槍吸取 2 000 μL蒸餾水于比色皿中，此為空白液。向標(biāo)準(zhǔn)液和待測液中各加入100 μL磷1號試劑和800 μL蒸餾水，混勻，再加入50 μL磷2號試劑，混勻。立即上機(jī)操作，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.6.3 有效鉀含量的測定 每組準(zhǔn)確稱取土壤樣品4 g，放入容量為100 mL三角瓶中，加入20 mL蒸餾水以及1號粉末1 g，在搖床中搖勻10 min，160 r·min-1，過濾，所得濾液用移液槍吸取 1 000 μL于比色皿中，此為待測液；用移液槍吸取900 μL蒸餾水，再加入100 μL鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，所得溶液為標(biāo)準(zhǔn)液；用移液槍吸取2mL蒸餾水于比色皿中，此為空白液。向標(biāo)準(zhǔn)液和待測液中各加入100 μL鉀1號試劑，混勻，再加入100 μL鉀2號試劑，混勻。停放5 min,再加入800 μL蒸餾水，立即上機(jī)操作，記錄數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 株高測量結(jié)果與分析

從圖2可以看出，在經(jīng)過施肥處理的茶樹處理組中，在第二次記錄數(shù)據(jù)時(shí)，第7組的長速最快，增長達(dá)到了56 cm，第30組的生長速度較慢，增長了11 cm，在經(jīng)過復(fù)合微生物肥施肥處理的30株樣品植株中，其平均株高達(dá)到了102.73 cm，初次測量時(shí)平均株高為74.67 cm，植株平均增高達(dá)到了28.06 cm，增幅達(dá)37.58%。

從圖3中可以看出，沒有經(jīng)過施肥處理的對照組，在進(jìn)行第二次測量的時(shí)候，第47組的長速最快，增長達(dá)到了30 cm，第35組的生長速度較慢，僅生長了2 cm，在未經(jīng)過復(fù)合微生物肥施肥處理的30株樣品植株中，其平均株高為89.90 cm, 初次測量時(shí)平均株高為73.87 cm，植株平均增高達(dá)到了16.03 cm，增幅為21.66%。

圖2 實(shí)驗(yàn)組株高測量結(jié)果

圖3 對照組株高測量結(jié)果

圖4 實(shí)驗(yàn)組與對照組株高平均值比較結(jié)果

結(jié)合實(shí)驗(yàn)組和對照組的數(shù)據(jù)來看，在初次測量時(shí)，為保證實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性、準(zhǔn)確性，在選擇實(shí)驗(yàn)對象時(shí)，選取的實(shí)驗(yàn)組樣本即施肥處理的30株茶樹比選取的對照組即未施肥處理的30株茶樹在平均株高上僅高出0.8 cm，在第二次測量時(shí)，實(shí)驗(yàn)組即施肥處理的茶樹比對照組即未施肥處理的茶樹僅高達(dá)12.83 cm，在實(shí)驗(yàn)組的30組樣本中，有29組的增長高度高于對照組的平均水平，有1組的增長高度略低于對照組的平均水平。經(jīng)Excel的顯著性分析結(jié)果顯示，復(fù)合微生物肥對茶樹的生長具有促進(jìn)作用，且效果明顯。

2.2 茶多酚含量測量結(jié)果與分析

由表1可以看出，經(jīng)過施肥處理的15組茶樹樣品中，其茶葉中的茶多酚含量最高可達(dá)411.43 g·kg-1，最低為309.49 g·kg-1，極差為101.94 g·kg-1，平均含量為374.86 g·kg-1；未經(jīng)過處理的15株茶樹樣品中，其茶葉中的茶多酚最高為406.58 g·kg-1，最低為293.31 g·kg-1，極差為113.27 g·kg-1,平均含量為334.99 g·kg-1；經(jīng)過施肥處理的15株茶樹的茶葉的平均茶多酚含量比未經(jīng)過處理的15株茶樹樣品中茶葉的平均茶多酚含量高出36.87g·kg-1。在實(shí)驗(yàn)組的15組樣本中，有13組的增長高度高于對照組的平均水平，有2組的增長高度略低于對照組的平均水平，增長率達(dá)86.7%，且實(shí)驗(yàn)組和對照組的差異性極顯著(P=0.002832<0.01)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測量結(jié)果表明，復(fù)合微生物肥對茶樹的生長具有促進(jìn)作用，且效果明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該復(fù)合微生物肥有助于提高茶樹中茶多酚含量，進(jìn)一步提升茶葉的品質(zhì)。

表1 茶葉中茶多酚含量的測量數(shù)據(jù)

Tab.1 The measurement data of contents of tea polyphenols

處理組對照組平均值371.86334.99最大值411.43406.58最小值309.49293.31變異系數(shù)%(CV)0.07380.1092

2.3 葉綠素含量測量結(jié)果與分析

由表2我們可以知道經(jīng)過施肥處理的15組茶樹樣品中，其茶葉中的葉綠素含量最高可達(dá)1.04 mg·g-1，最低為0.98 mg·g-1，極差為0.06 mg·g-1，平均含量為1.00 mg·g-1；未經(jīng)過處理的15株茶樹樣品中，其茶葉中的茶多酚最高為1.01 mg·g-1，最低為0.96 mg·g-1，極差為0.05 mg·g-1,平均含量為0.986 mg·g-1；經(jīng)過施肥處理的15株茶樹的茶葉的平均茶多酚含量比未經(jīng)過處理的15株茶樹樣品中茶葉的平均茶多酚含量高出0.02 mg·g-1。在實(shí)驗(yàn)組的15組樣本中，有13組的增長高度高于對照組的平均水平，有2組的增長高度略低于對照組的平均水平，且實(shí)驗(yàn)組和對照組的差異極顯著(P=0.000253<0.01)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該復(fù)合微生物肥有助于茶樹中葉綠素含量的提高。

表2 茶葉中葉綠素含量的測量數(shù)據(jù)

Tab.2 The measurement data of contents of chlorophyll

處理組/(mg·g-1)對照組/(mg·g-1)平均值1.004320.98563最大值1.03537 1.01085 最小值0.98560 0.96176 變異系數(shù)%(CV)0.0125710.012715

2.4 土壤中銨態(tài)氮、速效磷、有效鉀含量測量結(jié)果與分析

2.4.1 銨態(tài)氮含量測量結(jié)果與分析

銨態(tài)氮是氮元素的一種自然存在狀態(tài)，它可以與其他形式的氮元素在某些條件下相互轉(zhuǎn)化，易溶解，因此能夠被植物快速吸收，同時(shí)也容易被水分帶走。從表3可以看出在經(jīng)過施用復(fù)合微生物肥處理的15個(gè)樣品中，銨態(tài)氮平均值達(dá)到了122.134 mg·kg-1，最大值為297.62 mg·kg-1，而未經(jīng)過施用復(fù)合微生物肥處理的15個(gè)樣品中，銨態(tài)氮的平均值為40.571 mg·kg-1，最大值為129.63 mg·kg-1，在平均值上增長了81.563 mg·kg-1，增幅達(dá)49.74%。增長態(tài)勢穩(wěn)定、良好，且實(shí)驗(yàn)組和對照組差異性極顯著(P=0.000772<0.01)。經(jīng)過試驗(yàn)結(jié)果證明，復(fù)合微生物肥有助于土壤中的銨態(tài)氮的固定，增加土壤中銨態(tài)氮的含量，有利于植物的生長。

2.4.2 速效磷含量測量結(jié)果與分析

速效磷指的是在土壤中容易被植株吸收的磷成分，也是評價(jià)土壤提供磷水平的一個(gè)重要指標(biāo)，當(dāng)速效磷的含量達(dá)到25 mg·kg-1時(shí)，即被稱為含磷較高的土壤[17]。由測量數(shù)據(jù)可以得出，復(fù)合微生物肥對速效磷在土壤中的固定并無顯著性差異(P=0.374855>0.05)，從表3可以看出，施用復(fù)合微生物肥的土壤速效磷的平均含量為58.169 mg·kg-1，降幅為6.09%，屬于含磷較高的土壤，未使用菌肥的土壤速效磷的含量為61.941 mg·kg-1，同屬于含磷較高的土壤。研究表明，施用枯草芽孢桿菌后，植物中的全氮、全磷、全鉀含量均增加[18]，即植物吸收的礦質(zhì)元素增加，有利于植物的生長。

2.4.3 有效鉀含量測量結(jié)果與分析

有效鉀含量是土壤提供鉀水平的一個(gè)重要指標(biāo)，據(jù)表3可以看出，經(jīng)過施肥處理的土壤，有效鉀的含量被控制在了 1 048.442 mg·kg-1，而未經(jīng)過施用復(fù)合微生物肥處理的土壤，有效鉀的含量達(dá)到了 1 566.292 mg·kg-1，施用菌肥后土壤中的有效鉀含量降低了約33%，且實(shí)驗(yàn)組和對照組具顯著性差異(0.01

表3 土壤中銨態(tài)氮、速效磷、有效鉀含量測量結(jié)果與分析

Tab.3 The contents measurements data and analysis of ammonium nitrogen、quick-impact phosphorus and effective potassium of chlorophyll

平均值(mg·kg-1)最大值(mg·kg-1)最小值(mg·kg-1)變異系數(shù)/%(CV)銨態(tài)氮(處理組)122.134 297.620 23.020 0.843752銨態(tài)氮(對照組)40.571 129.630 8.440 0.60022速效磷(處理組)58.169 163.040 10.940 0.375622速效磷(對照組)61.941 118.540 19.730 0.636471有效鉀(處理組)1 048.442 2 128.900 311.300 0.587958有效鉀(對照組)1 566.292 3 244.560 332.700 0.550017

3 討論

本實(shí)驗(yàn)所使用的復(fù)合微生物肥有助于茶樹的生長，促生長率達(dá)96%以上，選取樣本在9個(gè)月的時(shí)間里，普遍生長28 cm以上，增幅達(dá)37.58%；該菌肥對茶葉中茶多酚含量增加也很明顯，平均含量比未經(jīng)過施肥處理的植株增長了36.87g·kg-1，相較于未施肥處理的植株，茶多酚含量增長約11%；葉片中的葉綠素含量在經(jīng)過施肥處理后也有所提高，有利于植株進(jìn)行光合作用積累有機(jī)物，有利于植株的生長；同時(shí)，菌肥的使用對土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)有所影響，尤其是對銨態(tài)氮的作用，平均增長了81.563 mg·kg-1，極大地提高了土壤中的氮成分含量，也對肥力不均的現(xiàn)象有所改善，有效控制了土壤中高鉀含量的現(xiàn)象。

近幾年來，在農(nóng)民的種植方面，施肥是一個(gè)十分普遍的現(xiàn)象，種植和施肥已經(jīng)緊密地聯(lián)系在了一起，但是根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)證明，土地中作物對肥料的利用率不斷下降，由此可知，施用化肥不能保證土地常年增產(chǎn)，且大量施用化肥還會造成土壤污染、水污染等一系列問題。微生物菌肥的出現(xiàn)極大地改善了這一情況，菌肥中的枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌在活化后產(chǎn)生的分解酶，能有效的將土壤中的有機(jī)質(zhì)分解為小分子，釋放出無機(jī)鹽[20]。在植物發(fā)育的早期， 植物根際促生菌的使用會直接影響芽和植物根系的生長，從而提高植物吸收營養(yǎng)的能力以達(dá)到提高作物產(chǎn)量的作用[21]。將有機(jī)肥和復(fù)合微生物肥搭配使用，將會減少施肥用量，緩解土壤中肥力不均的問題[22]。除此之外，有研究證明，根際促生菌也有利于提高植物在干旱脅迫條件下造成的極端環(huán)境的存活率[23]，將菌肥與改性吸水性竹纖維搭配使用，還可以運(yùn)用到干旱土壤的種植，解決土壤板結(jié)，具有有效涵養(yǎng)水源，穩(wěn)定供給營養(yǎng)成分的作用。