陳瑩 梁棟 王小川 李國宏 梁穎 何捷

補血通絡丸是由本院醫(yī)生協(xié)定處方研制而成, 由黃芪、三七、當歸、地龍、甘草配伍組成, 具有補益氣血、活血通絡的功效, 主要用于股骨頭壞死及各類骨傷疼痛?，F(xiàn)執(zhí)行的制劑質量標準僅對黃芪進行薄層鑒別, 處方其他藥物無控制手段, 不能全面反映該制劑質量狀況。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段, 其是建立在中藥化學成分系統(tǒng)研究的基礎上, 可用于評價中藥材以及中藥制劑半成品質量的真實性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性［1］。因此, 本文在參考文獻［2-7］的基礎上, 以補血通絡丸為研究對象, 利用指紋圖譜的研究思路, 考察多種成分的變化情況, 對該制劑進行指紋圖譜研究, 用于產品批次間質量穩(wěn)定性評價, 同時為后續(xù)全面提高該制劑質量水平提供依據和參考, 報告如下。

1 材料來源

1.1 藥品與試劑 甘草苷(批號：111610-201005, 中國藥品生物制品檢定所)；10 批次補血通絡丸均由內江市中醫(yī)醫(yī)院提供。見表1。乙腈(Flesher)色譜純；甲醇(成都市科隆化學品有限公司)分析純、磷酸(西隴化工股份有限公司)分析純；水為超純水。

表1 補血通絡丸樣品批號表

1.2 儀器 高效液相色譜儀(Agilent1260)；電子分析天平(梅特勒-托力多AG285)；超純水機(上海摩勒科Molelement-1890V)；超聲波清洗機(天津市瑞普電子儀器公司)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 采用Agilent ZorbaxSB-C18色譜柱(4.6 mm× 250.0 mm, 5 μm), 以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相, 即以乙腈為流動相A、以0.1%磷酸溶液為流動相B, 按流動相梯度洗脫程序進行梯度洗脫。流動相梯度洗脫程序見表2。檢測波長為220 nm, 柱溫 25℃, 流速為1.0 ml/min, 進樣量為10 μl,檢測時間為65 min。理論板數按甘草苷計算應≥5000。

表2 流動相梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 制備對照品溶液 取甘草苷對照品適量, 精密稱定, 加入甲醇, 制成每1 ml 中含甘草苷50 μg 的溶液, 作為對照品溶液。

2.2.2 制備供試品溶液 取補血通絡丸適量, 研細, 混勻, 取約1 g, 精密稱定, 置具塞錐形瓶中, 加甲醇50 ml, 密塞, 超聲處理(功率250 W, 頻率40 kHz)30 min, 搖勻, 濾過, 取續(xù)濾液, 即得供試品溶液。

2.3 方法學的考察

2.3.1 精密度試驗 取同一批補血通絡丸制成的供試品溶液(批號：170911), 連續(xù)進樣6 次, 按“2.1”項下色譜條件進行測定, 結果各共有峰的相對峰面積和相對保留時間的RSD 值均＜2.0%。該方法和儀器的精密度均良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取同一批補血通絡丸制成的供試品 溶液(批號：170911), 分別在0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、24.0 h 進樣分析, 記錄HPLC 圖譜, 采用2012 年版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》進行評價, 各色譜圖的相似度＞0.95, 相對峰面積的RSD 值＜1.5%, 供試品溶液在放置24 h內穩(wěn)定。

2.3.3 重復性試驗 取同一批補血通絡丸(批號：170911), 按“2.2.2”項下方法平行操作, 制備6 份供試品溶液, 分別進樣分析, 記錄HPLC 圖譜, 采用2012 年版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》進行評價, 相似度均＞0.95, 且RSD 值為0.38%, 該方法重復性好。

2.4 指紋圖譜的建立及相似度評價

2.4.1 指紋圖譜的建立 分別取10 批次補血通絡丸, 按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液, 按“2.1”項下方法進行測定并記錄65 min 色譜圖, 結果所有色譜峰均集中在60 min內。選擇5～65 min 中色譜峰, 時間窗寬度為0.2 min, 進行全峰匹配。10 批次樣品色譜圖中, 有19 個共有峰, 且共有峰總面積占總峰面積＞85%, 由此建立標準圖譜。見圖1。經與對照品色譜圖相比對, 可確認圖中5 號峰為甘草苷、6 號峰為阿魏酸。由于5 號峰峰面積相對較大且保留時間適中, 且為補血通絡丸中的主要活性成分, 因此選該峰為內參比峰。計算共有峰峰面積和保留時間相當于內參比峰峰面積和保留時間的比值。各樣品共有峰的相對保留時間(平均值)依次為：0.406、0.539、0.913、0.963、1.000(S)、1.060、1.455、1.656、1.735、1.875、1.945、2.370、2.449、2.480、2.547、2.574、2.768、3.059、3.487；各樣品共有峰的峰面積全部標定并計算(取平均值)依次為：0.373、0.497、0.407、1.353、1.000(S)、0.232、0.272、0.292、0.271、0.753、0.588、0.249、0.152、0.264、0.135、0.137、0.197、0.606、0.641。

圖1 補血通絡丸標準指紋圖譜

2.4.2 相似度計算 將10 批次補血通絡丸色譜圖導入 2012 年版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》, 與建立的標準圖譜進行比較, 并對10 批次樣品的指紋圖譜進行相似度分析, 指紋圖譜相似度計算結果分別為：0.979、0.980、0.973、0.981、0.961、0.962、0.974、0.973、0.979、0.954, 相似度均＞0.95。

3 討論

本實驗對供試品提取溶劑、流動相系統(tǒng)及檢測波長進行了篩選研究。一般實驗多用甲醇及50%甲醇提取, 甲醇及50%甲醇都能提取制劑中有效成分, 峰高也基本一致, 但甲醇提取的成分更多, 主要特征峰強, 分離度最佳［8-10］, 故本研究選用甲醇作為樣品提取溶劑。選用乙腈-0.1%磷酸水作為流動相用于梯度洗脫, 所得19 個共有峰分離良好。用二極管陣列檢測器(DAD), 在203、220、240、250、270、290、300 nm 同時對一針樣品檢測, 檢測器在220 nm 處, 峰信號強且出峰多, 特征峰干擾少, 分離度好, 故本研究選用220nm作為指紋圖譜的檢測波長。

本研究建立的補血通絡丸指紋圖譜經過方法學考察, 19 個共有峰的相對峰面積和相對保留時間的精密度、穩(wěn)定性及重復性均好, 10 批次指紋圖譜的相似度均＞0.9, 能滿足中藥指紋圖譜測定要求, 且說明補血通絡丸的制備工藝穩(wěn)定。

本實驗建立的補血通絡丸的指紋圖譜可用于該制劑的質量控制, 評價批次間制劑的穩(wěn)定性, 同時, 該方法比常用的薄層色譜法先進、科學, 更能全面反映產品質量。