水 燕,徐增洪,劉國鋒,*

1 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心,無錫 214081 2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 無錫漁業(yè)學(xué)院,無錫 214081

土壤鹽漬化(鹽堿化)與次生鹽漬化是土地退化的主要形式,也是生態(tài)環(huán)境的一種惡化現(xiàn)象,是一個(gè)世界性的難題。我國是土壤鹽漬化危害最為嚴(yán)重的國家,鹽堿土地資源總額約為108hm2,尤其是西北地區(qū)的甘肅、寧夏、新疆等省區(qū)都不同程度發(fā)生鹽漬化危害[1]。土地鹽堿化問題與人類活動,尤其是農(nóng)業(yè)灌溉,密切相關(guān)。據(jù)統(tǒng)計(jì),全世界約有55%的土地分布在干旱及半干旱氣候帶,這些地區(qū)雨量稀少,干旱地區(qū)年降雨量一般不足250 mm[2]。發(fā)展灌溉是促使這些地區(qū)農(nóng)業(yè)發(fā)展的一項(xiàng)重要手段。然而因過量施用化肥及不合理的灌溉管理措施而形成的土壤次生鹽漬化的問題,也成為當(dāng)今農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要障礙之一[3]。國內(nèi)外學(xué)者在探究引起土壤次生鹽漬化的原因方面做了大量研究工作,因研究側(cè)重點(diǎn)的不同對次生鹽漬化形成的主要原因存有不同的觀點(diǎn)。部分學(xué)者認(rèn)為對于干旱地帶的大多數(shù)灌區(qū)來說,土壤次生鹽漬化的形成和發(fā)展是由于不合理的灌溉,用水不當(dāng)抬高了地下水位,加之強(qiáng)烈的蒸發(fā)而引起土壤鹽漬化[4]。

寧夏回族自治區(qū)位于西北地區(qū)東部、黃河中上游,地處中溫帶半干旱、干旱區(qū),降水稀少(平均年降水量292 mm),蒸發(fā)強(qiáng)烈(水面蒸發(fā)量1296 mm),當(dāng)?shù)厮Y源總量為1117億m3,僅占全國水資源總量的0.1%[5]。近年來,引黃灌區(qū)的土壤鹽漬化問題受到了寧夏自治區(qū)的高度關(guān)注[6]。銀川地區(qū)鹽堿地已占總耕地面積的49%以上,土壤鹽堿化已成為影響寧夏農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要問題之一。現(xiàn)階段學(xué)者對寧夏銀川平原鹽堿地研究較多,并取得了一定的成果。例如：倪細(xì)爐等[7]對鹽堿植物抗鹽性進(jìn)行綜合評價(jià),得出4種植物抗鹽能力依次為白刺>甘肅檉柳>黃花補(bǔ)血草>芨芨草的結(jié)論。張永宏等[8]指出應(yīng)用控制灌溉是寧夏引黃灌區(qū)鹽堿地水稻比較適宜的灌溉管理模式。簡而言之,目前大部分研究主要集中在甘肅鹽堿地土壤性質(zhì)和地面植物生長特性、灌溉模式等方面,對探索次生鹽漬化土壤的形成機(jī)制以及人類干預(yù)因素對鹽漬化土壤的利弊研究報(bào)道很少。

另一方面,土壤是土壤微生物的生存寄居場所,由于土壤有機(jī)質(zhì)含量酸堿度水分及土質(zhì)的不同,與此環(huán)境相適應(yīng)的土壤微生物種類也千差萬別。在同一地區(qū)不同地層的土壤微生物種類和數(shù)量也不一樣。鹽堿土壤微生物群落研究對于加強(qiáng)鹽生植物資源的開發(fā)和利用、改良鹽堿土壤等方面具有十分重要的意義。然而由于缺乏適宜鹽漬化土壤環(huán)境條件下微生物的分離和培養(yǎng)方法,對鹽漬化生態(tài)環(huán)境下土壤微生物類群的研究至今仍然很少,鹽漬化生態(tài)環(huán)境下微生物資源的開發(fā)與利用研究更是少之又少。

基于16S rRNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,PCR-DGGE)是一種重要的研究微生物群落多樣性的方法[9-10]。本研究以寧夏回族自治區(qū)石嘴山地區(qū)低洼池塘區(qū)域鹽漬化土壤為研究對象,利用PCR-DGGE技術(shù)分析不同深度土壤細(xì)菌類群多樣性及優(yōu)勢種群,研究結(jié)果將為鹽堿環(huán)境下土壤微生物資源分布和研究提供重要的理論依據(jù)。

1 研究區(qū)域和樣品采集

本研究區(qū)域位于寧夏回族自治區(qū)石嘴山市大武口地區(qū)星海鎮(zhèn)石嘴山蘭泰養(yǎng)殖合作社,該地分布有低洼池塘,底層土壤性質(zhì)為典型的硫酸鹽型鹽堿土,pH值為8.7—9.3。為達(dá)到農(nóng)戶增收并改良土壤環(huán)境的目的本養(yǎng)殖合作社于2013年引進(jìn)大宗淡水魚池塘養(yǎng)殖技術(shù)。地理坐標(biāo)為38°54′20″—38°55′25″N之間,106°21′31″—106°21′43″E之間。石嘴山市屬于溫帶大陸性氣候,降水量最大時(shí)期為7月份,約為24 mm。

圖1 采樣點(diǎn)分布圖Fig.1 The map of the sampling sites

于2016年7—9月份對鹽堿樣地進(jìn)行土壤樣品采集。隨機(jī)選取3個(gè)樣點(diǎn)(S1、S2和S3,圖1)、每個(gè)樣點(diǎn)進(jìn)行分層采集,從0—20 cm、20—40 cm、40—60 cm、60—80 cm 4個(gè)地層深度按五點(diǎn)采樣法采集土壤樣品。以表層混合土(control surface soil, CS)、底層混合土(control hybrid soil, CH)和植物根際土(control rhizosphere soil, CR)作為對照組。將土壤樣品放在便攜式冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室,放在-20℃冰箱保存,用于DGGE分析。

2 研究方法

2.1 土壤樣品的理化性質(zhì)測定

土壤樣品基本理化參數(shù)(含水量、燒失量、孔隙度、總氮、總磷、pH值等)采用常規(guī)方法測定：土壤pH值的測量選用上海雷磁PHS- 3C型pH計(jì)測定；總氮(total nitrogen, TN)、總磷(total phosphorus, TP)采用濃H2SO4消煮-比色法測定；燒失量(loss on ignition, LOI)即將在105—110℃烘干的原料在1000—1100℃灼燒后失去的重量百分比。土壤孔隙度由孔隙度測定儀(貝士德儀器,北京)測定；每個(gè)樣品有2個(gè)重復(fù),取其平均值。

2.2 土壤DNA的提取

采用Fast DNATMSPIN Kit For Soil提取樣品基因組DNA,操作方法按說明書進(jìn)行。提取的DNA經(jīng)Thermo NanoDrop 2000進(jìn)行核算質(zhì)量與濃度檢測。

2.3 細(xì)菌16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增

以樣品基因組DNA為模板,采用細(xì)菌通用引物GC- 338F和518R擴(kuò)增樣品16S rRNA高變區(qū)序列。GC- 338 F: 5′-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGGCGGGGCGGGGGCGCGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′,518 R：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′; 338 F: 5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′。PCR擴(kuò)增體系(50 μL)為：10×PCR buffer 5 μL；dNTP Mixture(2.5 mmol/L)3.2 μL；ExTaq(5 U/μL)0.4 μL；GC- 338 F(20 μmol/L)1 μL；518 R(20 μmol/L)1 μL；模板DNA 50 ng；補(bǔ)ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min,55℃復(fù)性45 s,72℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán)；最終72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit純化回收。擴(kuò)增結(jié)果用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測。PCR儀為Biometra公司生產(chǎn)的T-gradient,凝膠成像儀為Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝膠成像系統(tǒng)。

2.4 PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)及圖譜分析

取10 μL PCR的產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析。采用變性梯度為35%—55%、濃度為7%的聚丙烯酰胺凝膠在1×TAE緩沖液中150 V 60℃下電泳5小時(shí)。電泳完畢后采用銀染法染色,簡要步驟如下：1)固定液(乙醇50 mL和冰醋酸2.5 mL,定容至500 mL)固定15 min；2)Milli-Q純水清洗、20 s和2 min各一次；3)銀染液(硝酸銀1g和37% 甲醛0.75 mL,定容至500 mL)染色15 min；4)Milli-Q純水清洗、20 s和2 min 各一次；5)顯色液(氫氧化鈉7.5 g和37%甲醛2.5 mL,定容至500 mL)顯色5—7 min；最后用終止液(乙醇50 mL和冰醋酸2.5 mL定容至500 mL)終止反應(yīng)。

圖譜分析采用Bio-Rad公司的凝膠定量軟件Quantity One 4.6.5對樣品條帶分析[11]。依據(jù)戴斯系數(shù)Cs(Dice Coefficient)計(jì)算個(gè)附著基樣品間的相似性,對相似性結(jié)果用非加權(quán)組平均法(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic means,UPGMA)進(jìn)行聚類分析。

2.5 數(shù)據(jù)分析

多樣性指數(shù)是研究群落物種數(shù)和個(gè)體數(shù)以及均勻度的綜合指標(biāo)[12]。DGGE圖譜采用Quantity one軟件對每個(gè)樣品的電泳條帶數(shù)目、條帶密度進(jìn)行數(shù)字化分析,Shannon指數(shù)(H)[13]、豐度指數(shù)(S)和均勻度Pielou指數(shù)(E)[14]等指標(biāo)被用來比較不同樣品的多樣性情況。S指數(shù)是某樣品中所有條帶數(shù)目總和,其他算法為：

式中,pi為樣品中單一條帶的強(qiáng)度在該樣品所有條帶總強(qiáng)度中所占的比率；N為DGGE圖譜單一泳道上所有條帶的豐度；Ni為第i條帶的豐度。

測序結(jié)果采用DNAstar和Cluster軟件進(jìn)行序列分析,下載最相似的菌株序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹的參考序列。然后采用MEGA軟件,Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,自展數(shù)(bootstrap)為1000。PCA分析采用canoco軟件進(jìn)行。

所有數(shù)據(jù)均用軟件Excel和SPSS 19.0軟件用Duncan檢驗(yàn)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理和差異顯著性分析(P<0.05差異顯著)。同列數(shù)據(jù)后具有相同字母者,表示在0.05水平上差異不顯著。

2.6 條帶的切膠、克隆和測序

根據(jù) DGGE圖譜,挑選共有及特有的優(yōu)勢條帶。在紫外燈下用無菌手術(shù)刀片把選定的條帶從凝膠上切割下來,隨即浸泡于50 μL超純水中,并置于4℃過夜。用所得的浸提液作為模板用引物338 F和518 R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序與之前的相同。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒(Omega)進(jìn)行純化后與克隆載體(pGEM-T)連接,得到的陽性克隆子送往上海英俊有限公司測序。將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 土壤樣品理化性質(zhì)結(jié)果分析

本實(shí)驗(yàn)所測定土樣的理化性質(zhì)如表1所示,試驗(yàn)地區(qū)土壤的含水量在5.59%—23.64%之間,pH維持在7.98—9.06之間,處于堿性水平?？偭缀吭?.27—0.63 mg/g之間,總氮在0.15—0.51 mg/g之間,土樣較為貧瘠,孔隙度差異較大。從不同土壤深度來看,各個(gè)深度(從地下20 cm到80 cm)土壤樣品的基本理化參數(shù)之間并不存在顯著差異,然而不同采樣點(diǎn)之間的差異較大,表明該地區(qū)土壤性質(zhì)非常不均勻。其中表層土對照組的含水量非常低,pH值較高,鹽漬化程度較高；而根際土對照組的土壤理化指標(biāo)與非根際土之間并沒有顯著差異,表明在該地區(qū)植物根際對鹽漬化土壤的改良影響程度不大。

表1 采樣點(diǎn)信息和樣品理化性質(zhì)

Sample No., 樣品編號 sample number；MC, 含水量 moisture content；TN, 總氮 total nitrogen；TP, 總磷,total phosphorus；LOI, 燒失量 loss on ignition；CS, 表層混合土 control surface soil；CH, 底層混合土control hybrid soil；CR,植物根際土control rhizosphere soil；b同一列中的數(shù)值后字母不同表示該指標(biāo)有顯著差異(P<0.05)

3.2 細(xì)菌 16S rRNA的PCR擴(kuò)增

圖2 16S rRNA-V3區(qū)電泳結(jié)果 M：DL 2000Fig.2 The results of 16S rRNA-V3 region of bacteria M: L 2000

經(jīng)分光光度計(jì)檢測提取后樣品DNA的OD260/OD280值均在1.78—1.95,說明提取的DNA質(zhì)量良好,可以作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以GC- 338 F和518 R為引物經(jīng)巢式PCR后產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖2所示,條帶大小與細(xì)菌16S rRNA-V3區(qū)理論大小(約234 bp)相同,且無非特異性擴(kuò)增,可直接用于后續(xù)DGGE實(shí)驗(yàn)。

3.3 PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)指紋圖譜

對土壤樣品的DGGE指紋圖譜以及模式圖進(jìn)行了分析,結(jié)果如圖3所示。理論上DGGE圖譜中每一個(gè)條帶代表一種微生物,條帶的數(shù)目及灰度可以反映出細(xì)菌的種類及相對數(shù)量[15]。由圖可見,15個(gè)鹽堿地土壤樣品的可分辨條帶總數(shù)在4—24之間,其中3#樣品的可識別條帶數(shù)量最多(24條),4#、7#和13#樣品的條帶數(shù)量最少(4條)。不同土壤樣品的DGGE圖譜在遷移率及條帶灰度值方面均存在較大的差異,表明寧夏石嘴山地區(qū)鹽堿地土壤中的微生物多樣性豐富程度非常高,存在大量的細(xì)菌類群,并且土壤樣品中細(xì)菌優(yōu)勢菌群不盡相同。并且,不同土壤間具有許多共同的條帶,然而這些公共條帶的強(qiáng)度也不相同,說明這些供試土壤之間可能存在一些共有的細(xì)菌類型,但是土壤微生物在DNA水平上有明顯差異。

圖3 16S rRNA變性梯度凝膠電泳圖譜和模式圖(由Quantity One 4.6.2軟件生成)Fig.3 PCR-DGGE profiles and its digitized patterns (by Quantity one 4.6.2 software) Numbers represent the bands excised

3.4 相似性與聚類分析

戴斯相似性系數(shù)Cs的大小可以體現(xiàn)出群落間細(xì)菌種群的差異,基于DGGE圖譜的0/1矩陣計(jì)算的相似性矩陣如表 2所示。從表中可以看出,樣本之間Cs值在0—43.6%之間。13#和14#樣本作為對照組之間的Cs值最高,達(dá)到48%；10#和12#樣本之間的相似性系數(shù)次之,為43.6%,而這兩個(gè)樣本均來自于-80 cm的地層深度。以不同地層深度來比較,在-20 cm地層,1#、2#和3#樣本之間的相似性系數(shù)分別為12.9%、33.6%和25.9%；在-40 cm地層,4#、5#和6#樣本之間的相似性系數(shù)分別為31.5%、0和12.3%；在-60 cm地層,7#、8#和9#樣本之間的相似性系數(shù)分別為0、4.6%和7.9%；而在-80 cm地層,10#、11#和12#樣本之間的相似性系數(shù)分別為33.2%、43.6%和21.3%。這些結(jié)果表明,不同地層的樣本之間的相似性差異非常大,大體上來說,在表層(D<20 cm)土壤和底層(D>80 cm)土壤樣本之間的戴斯相似性系數(shù)較高,樣本之間細(xì)菌種群的差異程度較低,而中間層(20 cm

對PCR-DGGE圖譜獲得的0/1矩陣進(jìn)行的UPGMA聚類結(jié)果(圖4)顯示。從圖中可以看出15個(gè)樣本聚為2個(gè)分支,4#、5#、13#和14#樣本作為第一分支；其余作為第二分支,并且兩大分支之間的距離較遠(yuǎn)。而第二分支內(nèi)部進(jìn)一步聚為2個(gè)亞支。根據(jù)相似性和聚類結(jié)果可初步得出結(jié)論：相對于混合土壤樣品中細(xì)菌菌落多樣性程度而言,不同地層深度土壤樣品之間細(xì)菌群落多樣性程度相對較高；而根際土壤樣品中細(xì)菌群落多樣性沒有顯著表現(xiàn)。

圖4 0/1相似性矩陣的UPGMA聚類結(jié)果Fig.4 The result of UPGMA clustering based on the 0/1 similarity matrix of the microbiota from samplesDice Co-efficient數(shù)值表示相似性大?。痪垲悎D由軟件NTSYS 2.10e繪制；UPGMA：非加權(quán)組平均法 unweighted pair group method with arithmetic means

3.5 多樣性指數(shù)分析

多樣性指數(shù)是利用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法測度群落中物種數(shù)、個(gè)體數(shù)量及各物種均勻程度等方面的常用參數(shù)。Pielou指數(shù)(E指數(shù))用于測度群落中不同物種多度分布的均勻程度；Shannon指數(shù)(H指數(shù))和豐度指數(shù)(S指數(shù))常用于評價(jià)群落的多樣性,但前者能體現(xiàn)群落內(nèi)種群數(shù)和種群間個(gè)體分配的均勻性[16]。根據(jù)DGGE圖譜中條帶的數(shù)量與灰度計(jì)算各多樣性指數(shù)結(jié)果如圖5所示。從圖中看出,各土壤樣品之間豐度指數(shù)S指數(shù)在8—17之間,變化較大。然而大概來說,隨著地層深度的增加,S值逐步下降,雖在-60 cm地層深度豐度值減少較快,但變化幅度較小,顯示土壤細(xì)菌菌群種類與地層深度之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。Shannon指數(shù)H值在1.8—2.9之間,變化趨勢與S類似,表明多樣性程度隨著地層深度的增加逐漸降低。Pielou指數(shù)E值在0.903—0.956,變化幅度很小,表明各地層深度檢測樣本與對照組之間均勻程度較高。

表2 戴斯系數(shù)Cs比較PCR-DGGE圖譜的相似性矩陣

圖5 15個(gè)土壤細(xì)菌微生物樣品的多樣性指數(shù)Fig.5 The diversity index of bacteria among the samplesS index,豐度指數(shù) 指條帶數(shù)；H index,Shannon指數(shù) index,Pielou均勻度指數(shù) CS,表層混合土 control surface soil；CH,底層混合土control hybrid soil；CR,植物根際土control rhizosphere soil

3.6 主要電泳條帶的序列測定和系統(tǒng)發(fā)生分析

DGGE凝膠條帶回收后,以338 F和518 R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物純化后連接到pMD18-T載體上,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,篩選陽性克隆測序。16S rRNA-V3區(qū)特征片段經(jīng)DGGE分離條帶切割,共得到37條條帶。將條帶進(jìn)行克隆測序,所得到的序列大小在169—195 bp范圍內(nèi)。在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTN序列比對顯示其中5條條帶分別歸屬于2個(gè)細(xì)菌類群：變形細(xì)菌門Proteobacteria和擬桿菌門Bacteroidetes(表3),其中4條(Band 6、3、36和11)屬于變形細(xì)菌門的α,β和γ亞門,其余32條條帶為未知菌種。

其中S2號采樣點(diǎn)的-20 cm土壤深度樣點(diǎn)2#的土壤樣品回收條帶Band 6的DNA序列與Marinobacterpersicus(NR_109110)的序列相似性達(dá)100%,而這一條帶也存在于1#、6#和15#土壤樣品中,說明此種細(xì)菌在各采樣點(diǎn)中廣泛分布；6#樣品的回收條帶Band 3與γ-變形細(xì)菌門的Microbulbiferokinawensis(NR_112917)的序列相似性達(dá)98%,這一條帶也存在15#、8#和2#樣品中；而3#土壤樣品的回收條帶Band 10與擬桿菌門Bacteroidetes的Marivirgasericea(NR_112183)序列相似性達(dá)97 %,并沒有在其他土壤樣品中被檢測到。

表3 經(jīng)DGGE分離獲得的細(xì)菌16S rRNA-V3序列

a條帶編號與圖3所示對應(yīng)；b僅列出最高匹配度序列及名稱

圖6 DGGE圖譜條帶回收獲得的16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹 Fig.6 Neighbour-joining phylogenetic tree of the 16S rRNA obtained from retrieved DGGE bands

采用MEGA5軟件Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,自展數(shù)(bootstrap)為1000,系統(tǒng)發(fā)育樹如圖6所示。

4 討論

鹽堿地形成與氣候、地理?xiàng)l件、土壤質(zhì)地、植物類型以及耕作管理等因素有關(guān)。近年來寧夏地區(qū)土地鹽漬化程度加劇,其中僅銀川地區(qū)中度和重度鹽漬土面積達(dá)到4600 km2,占總面積的50%以上,屬于中度和輕度鹽化土類型,鹽分呈表聚趨勢。該地區(qū)土壤鹽漬化的原因是多方面的。一方面該地屬于干旱地區(qū),降水量小于蒸發(fā)量,溶解在水中的鹽分隨土壤毛細(xì)管水蒸發(fā)作用而積聚在土壤表層,使得表層土壤大量積鹽；另一方面該地地勢較低,地表和地下水運(yùn)動使得水溶性鹽隨著水從高處流向低處,在低洼地帶滯留,導(dǎo)致鹽分積聚。土壤灌溉管理不當(dāng)造成排水不暢等也進(jìn)一步加劇了土壤鹽漬化。

土壤微生物積極參與陸地生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)及能量轉(zhuǎn)化,與土壤理化性質(zhì)的環(huán)境條件密切相關(guān),是表征土壤肥力的重要指標(biāo)之一。土壤微生物群落活性及其多樣性不僅在很大程度上決定了生物地球化學(xué)循環(huán)、土壤有機(jī)質(zhì)的周轉(zhuǎn)及土壤肥力和質(zhì)量,也與耕作措施有關(guān)[17]。土壤鹽漬化不僅直接影響土壤中微生物活性,而且通過改變土壤的部分理化性質(zhì)來間接影響土壤微生物的生存環(huán)境,導(dǎo)致土壤微生物種群、數(shù)量及活性均與健康土壤有較大的差別。土壤理化性質(zhì)(電導(dǎo)率、硝態(tài)氮、總鹽)對微生物的生長有很大的影響,對表層土的影響遠(yuǎn)大于深層土。土壤中即使有機(jī)質(zhì)含量豐富,如果土壤鹽漬化嚴(yán)重,微生物仍不能正常生長。受土壤基本性質(zhì)影響最大的是細(xì)菌和放線菌,真菌對土壤鹽漬化的適應(yīng)性相對要強(qiáng)一些[18]。土壤鹽分升高,造成土壤微生物滲透脅迫,使土壤活性微生物種群數(shù)量降低,導(dǎo)致活體微生物分泌酶的數(shù)量減少。一般來說,細(xì)菌、放線菌數(shù)量與土壤全鹽含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,細(xì)菌的數(shù)量與土壤有機(jī)質(zhì)含量顯著相關(guān),即土壤鹽害程度越高,微生物數(shù)量越小。

當(dāng)前對于寧夏地區(qū)鹽漬化土壤菌群微生物的研究還相對較少,已有的研究表明在寧夏地區(qū)鹽漬化土壤微生物群落中細(xì)菌占絕對優(yōu)勢,其次是放線菌和真菌[19]。另有對寧夏典型鹽漬化土樣放線菌進(jìn)行分離篩選的研究結(jié)果表明,具有特殊抑菌活性功能菌為鏈霉菌(Streptomyces),形態(tài)特殊菌為擬無枝酸菌(Amycolatopsis),耐鹽菌株為諾卡氏菌(Nocardia),其他形態(tài)特殊菌株和耐鹽菌株均為擬諾卡氏菌(Nocardiopsis)[20]。而對寧夏地區(qū)不同類型鹽漬化土壤的分析顯示,土壤鹽漬化程度不同與耐鹽性放線菌比例直接相關(guān)。即重鹽化土壤中分布的耐鹽放線菌最多；其次為中度鹽漬化、輕度鹽漬化土壤,并且鹽漬土壤中放線菌分為僅能在鹽漬環(huán)境下才能良好生長的嗜鹽性放線菌和對鹽漬化的程度具有不同敏感度的耐鹽性放線菌[21]。另有學(xué)者從寧夏鹽漬化土壤中分離出硫氧化細(xì)菌,經(jīng)鑒定疑似為新種[22]。

由于PCR-DGGE圖譜能直觀地反映出不同性質(zhì)土壤細(xì)菌16S rRNA的多樣性,即可在分子水平反映土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)多樣性,在土壤生態(tài)研究中被廣泛應(yīng)用。在DGGE指紋圖譜中,不同位置的條帶代表不同的細(xì)菌類群；而條帶灰度值則反映出不同細(xì)菌類群相對量的多少。在不同泳道同一橫向位置的不同條帶一般被認(rèn)為是同一個(gè)細(xì)菌類群。本研究從寧夏鹽堿地土壤樣品中提取基因組總DNA,利用PCR-DGGE技術(shù)分析不同地層深度鹽堿地中微生物的種群構(gòu)成。從DGGE圖譜上可以看出,寧夏石嘴山地區(qū)鹽堿地土壤樣品中可分離到4—24條不等的條帶,說明該地區(qū)鹽堿地土壤中存在豐富的微生物資源,并且多樣性程度較高。從對照組來看,表層混合土(CS,13#樣本)含水量較低,土壤堿性強(qiáng)(pH>9.0),且相較于實(shí)驗(yàn)組在圖譜條帶數(shù)量上存在明顯劣勢,表明該地區(qū)表層土壤中鹽分積聚明顯,高堿性環(huán)境對大部分常規(guī)微生物造成脅迫導(dǎo)致其難以存活。與此相比,底層混合土壤(CH,14#樣本)和根際土壤(CR,15#樣本)的圖譜條帶豐富很多并且界限清晰可辨,說明底層土壤和根際土壤的生態(tài)環(huán)境在一定程度上要優(yōu)于表層土壤。這一結(jié)果為寧夏地區(qū)鹽堿地表層鹽分沉積理論提供了部分依據(jù)。

一直以來,灌溉管理和低洼地區(qū)池塘養(yǎng)殖對于改良鹽堿地土壤生態(tài)環(huán)境的影響都是學(xué)者們十分關(guān)注的問題。這些改良措施存在的利弊也在不斷被評估。在本研究中,實(shí)驗(yàn)樣本取自低洼池塘養(yǎng)殖多年的人工干預(yù)環(huán)境條件下,本研究結(jié)果在一定程度上能反映池塘養(yǎng)殖的改良措施對改善該地區(qū)土壤生態(tài)環(huán)境的作用和意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,樣本之間的相似性隨著土壤深度的不同差異較大,在表層(D<20 cm)土壤和底層(D>80 cm)土壤樣本之間的細(xì)菌種群的相似性相對較高(差異程度較低),而中間層(20 cm

對此我們推測,上述結(jié)果可能跟土壤含水量有關(guān)。一般來說,土壤含水量的多少會影響蛋白質(zhì)的流動性及土壤酶活性以及細(xì)胞膜的流動性,而這是土壤微生物能否存活的重要基礎(chǔ)。而土壤含水量的變化與土壤環(huán)境特性及土壤深度之間存在非常復(fù)雜的關(guān)系。如對松嫩平原鹽堿地土壤分析表明,大多數(shù)理化指標(biāo)如pH、土壤容重、有機(jī)碳含量、堿解氮含量、全氮含量,全磷含量、全鉀含量出現(xiàn)隨深度顯著變化[23]。而對青藏高原昆侖山埡口土壤的研究結(jié)果表明可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量與多樣性在一定程度上均與土壤深度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[24]。這與當(dāng)?shù)氐牡孛埠偷刭|(zhì)成因有很大的關(guān)系。在寧夏鹽堿地區(qū),由于地層地下水和表層灌溉等的交相作用,使得各深度土壤環(huán)境規(guī)律性相對較低,地域差異性也很大。在池塘表層區(qū)域(D<20 cm),由于養(yǎng)殖活動導(dǎo)致淤泥含水豐富,水中可溶性蛋白和浮游微生物移動擴(kuò)散相對容易,使得采樣點(diǎn)之間細(xì)菌菌群的相似性程度較高；隨著地層深度的增加,土壤含水量相對減少使得水中物質(zhì)和呼吸能量交換逐漸困難,土壤均一性逐漸降低,最終體現(xiàn)在細(xì)菌菌群上為各點(diǎn)之間相似性降低；在深度地層中(D>80 cm),土壤孔隙度相對提高,土壤間隙增大(但是含水量并沒有顯著變化),這或許是細(xì)菌菌群由于呼吸作用導(dǎo)致的相似性程度變高的一個(gè)考慮因素。然而,從實(shí)驗(yàn)方法上看,由于PCR-DGGE在分析土壤細(xì)菌多樣性方面分辨率不高,基于DGGE帶譜的相似性和UPGMA聚類分析結(jié)果會有較大偏差,使結(jié)果和結(jié)論的可信度較低。在后續(xù)研究中一方面可以有針對性地加大取樣點(diǎn)的位置和數(shù)量,增加實(shí)驗(yàn)基數(shù),有利于從數(shù)據(jù)中凝練規(guī)律,另一方面可以利用微生物高通量測序分析來進(jìn)一步深入這項(xiàng)研究。

本研究對圖譜中優(yōu)勢條帶經(jīng)切膠回收克隆測序結(jié)果顯示,該鹽堿地土壤中主要的優(yōu)勢種群分布在2個(gè)細(xì)菌類群：變形細(xì)菌門Proteobacteria和擬桿菌門Bacteroidetes,此外還有32條優(yōu)勢條帶序列屬于未培養(yǎng)菌。變形菌門和擬桿菌門是構(gòu)成土壤和污泥微生物群落的主要種群,本研究表明這兩種微生物種類在鹽漬化土壤環(huán)境中也有廣泛分布[16]。然而,大部分優(yōu)勢菌種尚未被鑒定的結(jié)果說明,這些優(yōu)勢菌株可能是目前尚且不能培養(yǎng)或者是難獲得純培養(yǎng)物的新種資源,這些菌株長期適應(yīng)干旱、有機(jī)質(zhì)缺乏、鹽堿度較高的極端環(huán)境,最終成為優(yōu)勢菌株。對這些優(yōu)勢菌株展開研究不僅能進(jìn)一步豐富地球微生物資源,而且對于鹽堿地鹽漬化土壤的改良和生態(tài)發(fā)展等方面的應(yīng)用都具有重要的意義。

總而言之,本研究采用基于16S rRNA的PCR-DGGE技術(shù)對寧夏石嘴山地區(qū)低洼池塘不同深度土壤的細(xì)菌群落多樣性和優(yōu)勢種群進(jìn)行分析,研究結(jié)果在一定程度上暗示了該地區(qū)鹽堿地的形成機(jī)制之一可能是表層低洼土壤的鹽分堆積；并且人工養(yǎng)殖活動對于改善土壤生態(tài)環(huán)境具有一定積極作用。