林奕云，鄭家概，付 強(qiáng)，丁少曼，肖可茵，盧嘉豪

(中國(guó)廣州分析測(cè)試中心 廣東省分析測(cè)試技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070)

蘆薈苷，又稱蘆薈大黃素苷或蘆薈素，是蘆薈的主要活性成分。蘆薈不僅有抗炎、抗輻射等功效，還能夠抗癌變、抗衰老、調(diào)節(jié)血糖[1-2]。近年來(lái)，隨著人們健康養(yǎng)生意識(shí)的提高，植物飲料受到越來(lái)越多人的青睞，涼茶等天然植物飲料銷(xiāo)量迅速增長(zhǎng)[3]。以蘆薈為原料的植物飲料的相關(guān)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)尚未出臺(tái)，只對(duì)植物飲料原輔料的要求中提到不得使用或添加非食品用原料[4-5]，然而，《歐盟食品中化學(xué)污染物限量規(guī)定》對(duì)飲料中蘆薈苷的限值為0.1 mg/kg。因此，建立植物飲料中蘆薈苷準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)方法，具有重要的意義。

目前關(guān)于蘆薈苷的檢測(cè)方法有：分光光度法[6]、薄層掃描法[7]、液相色譜法[8-10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-12]等。由于飲料中的蘆薈苷含量很低，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法具有靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)等特點(diǎn)。因此，為有效監(jiān)控蘆薈苷在植物飲料中的含量，本文優(yōu)化了液相色譜條件、質(zhì)譜條件，建立了超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法測(cè)定植物飲料中蘆薈苷含量的分析方法。該方法靈敏度高、回收率和重現(xiàn)性良好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以檢測(cè)植物飲料中低含量的蘆薈苷，為控制產(chǎn)品質(zhì)量提供數(shù)據(jù)及技術(shù)手段支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備與試劑

Agilent 1290/6460A超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫科技公司；Sartorius BSA224S 電子天平，德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；XW-80A型微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器有限公司；KQ-2200型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q超純水儀，美國(guó)Millipore公司。

蘆薈苷(Aloin，CAS：1415-73-2，純度：97.71%)購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；乙腈，色譜純，美國(guó)Honeywell公司；甲醇，分析純，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取10.0 mg蘆薈苷標(biāo)準(zhǔn)品于棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱中避光保存。

1.3 樣品前處理

稱取樣品5.0 g于25 mL棕色容量瓶中，加入15 mL甲醇，渦旋，混合均勻后超聲提取10 min，冷卻至室溫，用水定容至25 mL，過(guò)0.22 μm濾膜上機(jī)測(cè)定。

1.4 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

稱取5份空白基質(zhì)樣品，分別加入適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3進(jìn)行處理，制成濃度為1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.5 色譜/質(zhì)譜測(cè)定條件

1.5.1 液相色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×50 mm，2.7 μm)；流動(dòng)相A為乙腈，B為水；柱溫30 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5.0 μL；梯度洗脫程序如下：0～3.0 min，40%～90%A，3.0～3.5 min，90%A，3.6～5.0 min，40%A。

1.5.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，采用負(fù)離子電離模式，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。干燥氣溫度為300 ℃，干燥氣流量5 mL/min，霧化器壓力40 psi，鞘流氣溫度350 ℃，鞘流氣流量11 mL/min，毛細(xì)管電壓3500 V。蘆薈苷的MRM參數(shù)列于表1，安捷倫MassHunter軟件用于定性和定量分析。

表1 蘆薈苷的MRM參數(shù) Table 2 MRM parameters of Aloin

注：*表示定量離子對(duì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

分別以乙腈-水、甲醇-水作為流動(dòng)相，考察對(duì)目標(biāo)化合物離子化程度的影響。結(jié)果表明，以乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，蘆薈苷的響應(yīng)值明顯高于流動(dòng)相為甲醇-水時(shí)的響應(yīng)值。因此，選用乙腈-水作為流動(dòng)相。

目標(biāo)化合物的離子化效率還會(huì)受到流動(dòng)相中加入的添加劑影響[13]。比較在水相中分別加入0.1%甲酸、5 mmol/L乙酸銨對(duì)目標(biāo)化合物離子化效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)水相中加入甲酸或乙酸銨，都抑制了離子化效率，蘆薈苷響應(yīng)值均有所降低，因此，試驗(yàn)采用乙腈-水作為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫。

比較了Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×50 mm，2.7 μm)和SB-C18柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)的分離效果。結(jié)果顯示：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱的分離時(shí)間較短，蘆薈苷峰形尖銳對(duì)稱、不拖尾。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

使用1.0 μg/mL蘆薈苷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，分別在ESI+、ESI-的模式下進(jìn)行全掃描，掃描發(fā)現(xiàn)在負(fù)離子模式下，蘆薈苷的靈敏度更高，因此，選擇擇負(fù)離子模式，m/z 417.0作為蘆薈苷測(cè)定的母離子。采用SIM掃描方式，優(yōu)化出最佳碎裂電壓，146 V條件下，蘆薈苷母離子的響應(yīng)最高。再采用Product Ion掃描方式，蘆薈苷經(jīng)碰撞后產(chǎn)生的碎片離子有m/z 297.0 和m/z 268.0，其中m/z 297.0相對(duì)豐度最高，作為定量離子，m/z 268.0作為定性離子。最后，優(yōu)化出子離子的最佳碰撞能量，得到表1所示的質(zhì)譜參數(shù)。最終優(yōu)化了質(zhì)譜條件，得到如圖1所示的蘆薈苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖，如圖2所示的陽(yáng)性樣品和陰性樣品的總離子流TIC圖。

圖1 蘆薈苷的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖

Fig.1 MRM Chromatograms of Aloin

圖2 樣品的總離子流(TIC)色譜圖Fig.2 TIC Chromatograms of samples

2.3 線性范圍

本文采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，以消除基質(zhì)干擾，提高定量準(zhǔn)確性。按照1.4配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蘆薈苷的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。結(jié)果表明，蘆薈苷在1.0～25 ng/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性回歸方程為Y=5641.3X-265.5，相關(guān)系數(shù)r≥0.9995，具有良好的線性關(guān)系，表明該方法適用于植物飲料中蘆薈苷的定量分析。

2.4 檢出限和定量限

蘆薈苷的的檢出限為1.0 μg/kg(信噪比S/N=3)，定量限為3.0 μg/kg(信噪比S/N=10)。

2.5 回收率和精密度

準(zhǔn)確稱取3份空白樣品，每份5.0 g，加入蘆薈苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加量為5.0 μg/kg、10 μg/kg、25 μg/kg，按照1.3方法進(jìn)行樣品處理。每個(gè)添加水平測(cè)定6次，考察方法的精密度。從表2可以看出，在5、10和25 μg/kg這3種加標(biāo)水平下目標(biāo)化合物的平均回收率為91.2%～95.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD6)為3.15%～6.10%，表明方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性較好，可滿足日常分析要求。

表2 蘆薈苷的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6) Table 2 Spike recoveries and RSD of Aloin in blank samples (n=6)

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定植物飲料中蘆薈苷含量的方法，樣品經(jīng)甲醇提取，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，降低了基質(zhì)干擾，提高了分析靈敏度。該方法靈敏度高、回收率和重現(xiàn)性良好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以檢測(cè)植物飲料中低含量的蘆薈苷，為控制產(chǎn)品質(zhì)量提供數(shù)據(jù)及技術(shù)手段支持，為植物飲料中非法添加非食品用原料的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)研究提供了可靠的檢測(cè)手段。