蔡 偉，嚴(yán)卓晟 ，William Jia Lan，彭 彬，鐘堅(jiān)文 ，張 杰 ，胡瓊波

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣州市金稻農(nóng)業(yè)科技有限公司，廣東 廣州 510075；3.上海交通大學(xué)法學(xué)院，上海 200240；4.廣東省農(nóng)業(yè)機(jī)械化技術(shù)推廣總站，廣東 廣州 510500）

【研究意義】水稻是我國(guó)的主要糧食作物，其高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)是我國(guó)糧食安全的重要基礎(chǔ)。隨著人們生活水平的提高，人們對(duì)食品安全問(wèn)題日益關(guān)注。種子處理技術(shù)因其具備環(huán)境污染小、對(duì)病蟲(chóng)防治效果好的特點(diǎn)，越來(lái)越受到政府的重視與市場(chǎng)的歡迎［1-2］。超聲波是一種頻率超過(guò)20 kHz的壓力波，它具有很好的方向性與穿透能力，因而在衛(wèi)生健康、科研與工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用［2］。種子超聲波處理不同于化學(xué)處理，其安全性更好，無(wú)污染，處理效率更高，更方便易用，因而近年來(lái)得到廣泛發(fā)展。但是超聲波處理水稻種子尚處于發(fā)展初期，它可促進(jìn)發(fā)芽與培育壯秧［2］，但是否具有殺菌作用或者對(duì)水稻芽期和苗期病害的防治作用不得而知。研究超聲波對(duì)水稻種谷表面微生物的影響有助于促進(jìn)種子處理技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，為保證國(guó)家糧食安全做出貢獻(xiàn)。【前人研究進(jìn)展】超聲波處理種子技術(shù)已經(jīng)用于小麥、玉米、油菜、國(guó)槐、鎖陽(yáng)及蘇鐵等多種作物與林木植物，可促進(jìn)種子萌發(fā)、提高植物抗病性，以及提高產(chǎn)量［3-7］。超聲波處理水稻種子的研究報(bào)告較少，主要考察了超聲波對(duì)種谷的刺激作用、種谷體內(nèi)各種生理活性的改變，以及對(duì)水稻種子發(fā)芽、出苗及產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)超聲波處理能提高水稻種子活力、打破種子休眠、促進(jìn)種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)、增強(qiáng)種子的抗逆性以及提高產(chǎn)量［2,8-9］?？梢?jiàn)，超聲波處理水稻種子技術(shù)應(yīng)用還很粗放，必須進(jìn)一步掌握超聲波對(duì)種谷本身及其表面微生物的影響規(guī)律，優(yōu)化處理方法?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】針對(duì)目前水稻種子超聲波處理技術(shù)發(fā)展不足，不了解超聲波對(duì)水稻種谷表面微生物影響的相關(guān)數(shù)據(jù)的前提下，本試驗(yàn)設(shè)置不同的超聲波種谷處理方式，包括濕法與干法處理，以及使用不同的超聲波頻率，比較不同處理方式對(duì)種谷表面不同種類(lèi)真菌與細(xì)菌的殺菌效果。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】發(fā)現(xiàn)不同超聲波處理方式對(duì)種谷表面不同種類(lèi)微生物的影響規(guī)律，為種谷超聲波處理技術(shù)最優(yōu)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻品種為象牙香占，種谷為廣州市金稻農(nóng)業(yè)科技有限公司貯藏的生產(chǎn)用種。超聲波處理設(shè)備為JD-50L植物種子增產(chǎn)處理機(jī)（廣州市金稻農(nóng)業(yè)科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)設(shè)超聲波濕法（Twet）、50 kHz超聲波干法（Tdry1）和25 kHz超聲波干法（Tdry2）3個(gè)處理。Twet處理取種谷2 kg浸泡在2 L自來(lái)水中并用25～50 kHz變頻超聲波處理30 min，Tdry1處理將正常干燥種谷2 kg用50 kHz固定頻率超聲波處理30 min，Tdry2處理分別將正常干燥種谷2 kg用25 kHz固定頻率超聲波處理30 min，分別設(shè)濕法對(duì)照（CK1）與干法對(duì)照（CK2），3次重復(fù)。

1.3 種谷表面微生物分離純化

從上述處理與對(duì)照中分別取種谷1 g，置于99 mL 0.05%的吐溫-80的溶液中，搖勻，靜置15 min，取0.1 mL上清稀釋于99.9 mL 0.05%吐溫-80溶液中混勻?yàn)榫鷳乙?。?.1 mL上述菌懸液接種于PDA平板上（90 mm×15 mm一次性培養(yǎng)皿，海門(mén)市如意實(shí)驗(yàn)器材廠），用三角棒均勻涂布，每個(gè)處理5個(gè)平板，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，分離細(xì)菌，用接種針挑取細(xì)菌菌落于PDA平板上劃線繼續(xù)純化培養(yǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)，再用滅菌牙簽挑取單菌落于裝有5 mL液體LB的離心管里在37℃的恒溫振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，離心后分離菌體，可斜面與砂土管保藏。真菌純化則在上述DPA平板培養(yǎng)4～7 d后，用接種針挑取菌絲于PDA平板上，待菌落純化后斜面與砂土管保藏菌種，備用。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將純化后的菌種分別接種于PDA平板上，恒溫培養(yǎng)，觀察菌落顏色、形態(tài)與大小變化，顯微鏡下觀察測(cè)量細(xì)菌菌體及真菌的菌絲、孢子與產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，拍照記錄。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定 細(xì)菌與真菌DNA的提取分別采用 Bacterial DNA Kit與HP Fungal DNA Kit 試劑盒（Omega Bio-tek, Inc., USA）。細(xì)菌的16S rDNA序列擴(kuò)增采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 和 1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）， PCR 反應(yīng) 在 T100?Thermal Cycler PCR 儀（Bio-Rad，USA）上完成，反應(yīng)總體系為50 μL，其中細(xì)菌基因組 DNA 2 μL，ddH2O 19 μL，2×Power taq PCR MasterMix（廣州擎科生物技術(shù)有限公司）25 μL，引物 27F 2 μL，引物 1492R 2 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。真菌rDNA ITS序列擴(kuò)增采用通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和 ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），所用儀器和PCR反應(yīng)體系、程序與細(xì)菌相似，只是DNA改為真菌基因組DNA 2 μL，引物ITS1 2 μL，引物 ITS4 2 μL。

PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，緩沖液為1×TAE，電壓150 V，電流220 mA，Marker DL2000作為分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物。電泳結(jié)束后，在凝膠成像儀上面檢測(cè)并拍照記錄，所得的特異性PCR產(chǎn)物tvrt生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序。將所測(cè)序列信息上傳Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)，取得登錄號(hào)，并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中用BLAST搜索同源性較高的相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)，將序列相同度≥98%定為同種菌株。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析與繪圖采用Excel 2000軟件（Microsoft Corporation, USA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波處理對(duì)種谷表面微生物菌落數(shù)量的影響

不同方法的超聲波處理對(duì)種谷表面的細(xì)菌與真菌的影響不同，總體上，超聲波濕法處理比干法處理對(duì)微生物影響更顯著，而50 kHz超聲波比25 kHz超聲波處理影響較大。

由圖1A、圖2可知，超聲波濕法處理（Twet）可顯著減少細(xì)菌的菌落數(shù)量，處理組的細(xì)菌菌落數(shù)為165個(gè)/平板，顯著低于CK1的373個(gè)/平板，而兩種超聲波干法處理（Tdry1和Tdry2）均不能減少細(xì)菌菌落數(shù)量。由圖1B、圖2可知，超聲波濕法處理（Twet）可顯著減少真菌菌落數(shù)，處理組的真菌菌落數(shù)為1個(gè)/平板，顯著低于CK1的1.3個(gè)/平板；50 kHz超聲波干法處理（Tdry1）有真菌菌落3個(gè)/平板，顯著低于CK2，但25 kHz超聲波干法處理（Tdry2）與CK2無(wú)顯著差異。

2.2 超聲波處理對(duì)種谷表面微生物種類(lèi)的影響

從種谷表面分離純化的細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)方法鑒定為15種（表1），都不是已經(jīng)報(bào)道過(guò)的植物病原菌，檢出最多的是肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae，其次為陰溝腸桿菌Enterobacter cloacae，它們?cè)诟鱾€(gè)處理與對(duì)照中都有大量檢出，且差異不大（圖1A，表1）。在濕法對(duì)照（CK1）中檢出了12種細(xì)菌，濕法處理中（Twet）共檢出7種細(xì)菌，未檢出銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa、粘金黃桿菌Chryseobacteriumgleum、鼠李糖短桿菌Brachybacteriumrhamnosum、變異賴(lài)氨酸桿菌Lysinibacillusvarians與成團(tuán)泛菌Pantoea agglomerans等5種在濕法對(duì)照（CK1）中出現(xiàn)的細(xì)菌（圖1A）。從干法處理（Tdry1，Tdry2）與干法對(duì)照（CK2）中檢出的細(xì)菌差異不大，除了甘蔗黃單胞菌Xanthomonas sacchari和嗜麥芽窄食單胞菌Stenotrophomonas maltophilia只在干法對(duì)照中出現(xiàn)的2種外，其他種類(lèi)在干法處理中都有檢出（圖1A，表1）。

從稻谷表面檢測(cè)到11種真菌（表2），以稻葉鞘腐敗病菌Sarocladium oryzae的檢出率最高，其次為草酸青霉菌Penicillium oxalicum，它們?cè)诟鱾€(gè)處理與對(duì)照中都被檢出（圖1B）。在濕法對(duì)照（CK1）中檢出9種真菌菌，濕法處理中（Twet）檢出7種真菌，未檢出再育鐮孢菌Fusarium proliferatum與串珠鐮孢菌Gibberella fujikuroi等2種在濕法對(duì)照（CK1）中出現(xiàn)的真菌（表2，圖1B）。從干法對(duì)照（CK2）中檢出10種真菌，50 kHz（Tdry1）與25 kHz（Tdry2）2個(gè)干法處理中分別檢出9種與6種真菌，但50 kHz干法處理（Tdry1）未檢出干法對(duì)照（CK2）中出現(xiàn)的多變根毛霉菌Rhizomucor variabilis、尖孢鐮孢菌Fusarium oxysporum、莖點(diǎn)霉Phomasp.與串珠鐮孢菌Gibberella fujikuroi等4種真菌（表2，圖1B）。

圖1 種谷表面分離的細(xì)菌（A）與真菌（B）菌落數(shù)量Fig.1 The number of bacterial colonies separated from the surface of rice

圖2 PDA平板上的微生物菌落Fig.2 Microbial colonies in PDA plates

3 討論

水稻芽期與苗期是比較脆弱的生育期，容易受到不良環(huán)境及有害生物的侵襲，種子帶菌是傳播惡苗病、綿腐病、立枯病、稻瘟病、稻曲病等病害的主要途徑，因此，發(fā)展種子處理技術(shù)是提高種谷發(fā)芽率以及培育壯苗壯秧的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1］。本研究結(jié)果表明，超聲波處理種谷可以殺滅其表面細(xì)菌與真菌，但殺菌效果與處理方式有關(guān)，濕法處理比干法處理效果好，這可能是由于在濕法處理時(shí)水被超聲空化，形成瞬時(shí)局部的高溫和高壓，達(dá)到殺菌效果；干法處理時(shí)50 kHz超聲波比25 kHz超聲波殺菌效果好，這是由于25 kHz超聲波干法處理的能量不足，導(dǎo)致其殺菌效果不如50 kHz超聲波干法處理，這與制糖工藝中的超聲波殺菌原理相似，殺菌效果與超聲波的頻率、強(qiáng)度及處理介質(zhì)相關(guān)。為了進(jìn)一步提高超聲波處理種谷的殺菌效果，應(yīng)該以濕法處理為基礎(chǔ)，進(jìn)一步優(yōu)化超聲波頻率與強(qiáng)度以及水分與溫度控制等條件，達(dá)到最好的殺菌效果。

表1 種谷表面的細(xì)菌種類(lèi)Table 1 Bacterial species on the Surfaces of Rice seeds

表2 種谷表面的真菌種類(lèi)Table 2 Fungal species on the Surfaces of Rice seeds

本研究鑒定的種谷表面真菌種類(lèi)與劉西麗等［10］的研究結(jié)果大體上一致。許多植物病原真菌如鐮刀菌屬的一些種類(lèi)，包括再育鐮刀菌Fusariumproliferatum、尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum、串珠鐮刀菌Fusariummoniliforme及木賊鐮刀菌Fusariumequiseti等，它們都是水稻立枯病的病原菌［11］，還有尚未鑒定種的莖點(diǎn)霉屬Phomasp.和鐮刀菌Fusariumsp.也可能是植物致病菌。超聲波對(duì)上述病菌都有一定殺菌作用，這些種傳病原的減少可有效減少水稻芽期與幼苗期病害，促進(jìn)水稻壯秧壯苗。其中，多變根毛霉菌Rhizomucor variabilis被超聲波顯著抑制，但該菌多見(jiàn)于機(jī)會(huì)引起人和動(dòng)物皮質(zhì)感染［12］，而它與水稻的互作關(guān)系未見(jiàn)研究報(bào)導(dǎo)；Sarocladium oryzae是水稻葉鞘腐敗病的病原菌，影響水稻結(jié)實(shí)，降低稻谷產(chǎn)量與米質(zhì)［13］。另外4種真菌，即木賊鐮孢菌Fusariumequiseti、草酸青霉菌Penicilliumoxalicum、黃曲霉菌Aspergillusflavus和節(jié)菱孢霉菌Arthrobotrysfoliicola，超聲波殺菌效果不顯著，可能是因?yàn)槠湄S度相對(duì)較高。

本研究檢測(cè)到的細(xì)菌中，只見(jiàn)植物病原菌甘蔗黃單胞菌Xanthomonassacchari報(bào)道，可引起甘蔗葉片褪綠條紋?。↙eafChloroticStreak Disease）［14］，但該菌也可能是一種內(nèi)生菌，并且從水稻上分離了該菌的一個(gè)菌株，對(duì)一些病原菌有拮抗作用，具有作為生防菌的潛力［15-16］，超聲波處理對(duì)該菌具有殺菌效果，但其對(duì)水稻生長(zhǎng)發(fā)育有何效應(yīng)需要進(jìn)一步研究。其他被檢測(cè)到的細(xì)菌均非植物病原菌，而多為人的條件性致病菌（當(dāng)人體免疫力低下時(shí)可能被感染），如假單胞菌Pseudomonasaeruginosa、粘金黃桿菌Chryseobacteriumgleum、成團(tuán)泛菌Pantoea agglomerans、嗜麥芽窄食單胞菌Stenotrophomonas maltophilia、棲稻假單胞菌Pseudomonas oryzihabitans（棲稻黃單胞菌Flavimonas oryzihabitans）、陰溝腸桿菌Enterobactercloacae、肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae、格氏多列桿菌Pluralibactergergoviae及居泉沙雷氏菌Serratia fonticola等都屬于此類(lèi)細(xì)菌［17-20］。超聲波對(duì)前5種有殺菌作用，但對(duì)其余的殺菌效果較差，這可能是由于后者的豐度較高，陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌、及居泉沙雷氏菌等都有很高的分離率。另外2種菌（鼠李糖短桿菌Brachybacterium rhamnosum和變異賴(lài)氨酸桿菌Lysinibacillus varians）目前未見(jiàn)該菌對(duì)人有致病性的研究報(bào)道，超聲波對(duì)其殺菌效果也比較好，可能也與其豐度較低有關(guān)。

4 結(jié)論

超聲波處理對(duì)種谷有殺菌作用，但殺菌效果與超聲波處理方式及微生物種類(lèi)及其豐度有關(guān)?？傮w上，超聲波濕法處理（Twet）優(yōu)于干法處理，而50 kHz超聲波干法處理（Tdry1）優(yōu)于25 kHz超聲波干法處理（Tdry2）。本研究檢測(cè)到的15種種谷表面細(xì)菌中，僅甘蔗黃單胞菌Xanthomonas sacchari是植物病原菌，其他大多為條件性人的致病菌。超聲波對(duì)甘蔗黃單胞菌Xanthomonas sacchari、假單胞菌Pseudomonasaeruginosa、粘金黃桿菌Chryseobacteriumgleum、成團(tuán)泛菌Pantoea agglomerans、嗜麥芽窄食單胞菌Stenotrophomonas maltophilia等豐度較低的細(xì)菌殺菌效果較好，但對(duì)陰溝腸桿菌Enterobactercloacae和肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae等豐度較高的細(xì)菌殺菌效果較差；檢測(cè)到的11種真菌中許多是植物病原菌，超聲波對(duì)層生鐮刀菌Fusariumproliferatum、尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum、串珠鐮刀菌Fusarium moniliforme，木賊鐮刀菌Fusariumequiseti與莖點(diǎn)霉菌Phomasp.等殺菌效果較好，而對(duì)稻葉鞘腐敗病菌Sarocladiumoryzae及草酸青霉菌Penicillium oxalicum等殺菌效果不顯著，可能是由于后者豐度太高所致殺菌效果偏低。超聲波處理對(duì)種谷表面的植物病原菌殺菌作用可能是是其促進(jìn)水稻壯秧壯苗增產(chǎn)的原因。本研究結(jié)果可指導(dǎo)超聲波稻種處理技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化研究，促進(jìn)該技術(shù)在種子處理中的發(fā)展與應(yīng)用。