梅靜霞， 張 楠， 王 強(qiáng)， 袁久剛， 范雪榮

(生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))， 江蘇 無(wú)錫 214122)

羊毛織物由于表面鱗片層的存在導(dǎo)致其在洗滌過(guò)程中會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的氈縮現(xiàn)象，大大降低了羊毛的使用價(jià)值[1]。傳統(tǒng)的防氈縮加工主要采用氯化處理來(lái)破壞鱗片或者通過(guò)聚合物沉積覆蓋鱗片[2]。氯化處理過(guò)程中產(chǎn)生的可吸收有機(jī)鹵化物(AOX)對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重危害，而聚合物覆蓋法會(huì)惡化羊毛本身優(yōu)良的手感，導(dǎo)致織物舒適性下降[3-4]。

近年來(lái)，蛋白酶以其高效、作用專(zhuān)一、使用條件溫和以及環(huán)境友好的優(yōu)勢(shì)在羊毛防氈縮整理中的應(yīng)用越來(lái)越受關(guān)注[5]。由于羊毛鱗片含有大量二硫鍵交聯(lián)的角蛋白質(zhì)，因此，蛋白酶會(huì)優(yōu)先水解非角質(zhì)化可溶脹的細(xì)胞膜復(fù)合物(CMC)，進(jìn)而通過(guò)細(xì)胞間間隙進(jìn)入纖維內(nèi)部，破壞纖維內(nèi)部主體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致纖維強(qiáng)力急劇下降[6]。相關(guān)研究[7-9]表明，通過(guò)化學(xué)修飾使蛋白酶分子體積增大，可以控制蛋白酶只作用于羊毛鱗片層而不通過(guò)CMC進(jìn)入皮質(zhì)層，以此來(lái)降低纖維主體損傷。但需指出的是，由于蛋白酶具有專(zhuān)一性，只能水解肽鍵，對(duì)富含角蛋白質(zhì)的鱗片層的水解作用有限，因此，不得不采用各種預(yù)處理[5]如過(guò)氧化氫、高錳酸鉀、亞硫酸鈉等氧化劑/還原劑預(yù)先破壞角蛋白質(zhì)中的二硫鍵，以此來(lái)增強(qiáng)修飾酶的作用效果。

本文研究從水解羊毛鱗片中富含二硫鍵交聯(lián)的角蛋白質(zhì)出發(fā)，采用碳二亞胺/琥珀酰亞胺(EDC/NHS)使聚乙二醇二羧酸(HOOC-PEG-COOH)和L-半胱氨酸對(duì)蛋白酶進(jìn)行修飾，開(kāi)發(fā)了一種新型的改性蛋白酶，以期來(lái)強(qiáng)化修飾酶對(duì)鱗片層中角蛋白的水解作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

蛋白酶(Savinase 16 L)，諾維信生物技術(shù)有限公司；聚乙二醇二羧酸(HOOC-PEG-COOH)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，98%)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，98%)和嗎啉乙磺酸(MES，99%)，阿拉丁生化試劑股份有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

羊毛織物(華達(dá)呢，200 g/m2)和羊毛纖維(35 μm)，無(wú)錫協(xié)新毛紡織有限公司。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

HD026NS型電子織物強(qiáng)力機(jī)(南通宏大實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，CM195型冰凍切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司)，Y(B)089D型全自動(dòng)縮水率試驗(yàn)機(jī)(溫州大榮紡織標(biāo)準(zhǔn)儀器廠)，JC2000D4型接觸角測(cè)試儀(上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司)，SU1510型掃描電子顯微鏡(日本日立公司)，DMM-300C型光學(xué)顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司)。

1.3 蛋白酶的化學(xué)修飾

配制50 mmol/L pH值為5.5的MES緩沖溶液和EDC/NHS(量比為1∶1)溶液備用。首先，向MES溶液中加入1 mL HOOC-PEG-COOH和EDC/NHS溶液(羧基的2倍當(dāng)量)，37 ℃磁力攪拌30 min活化羧基；再加入L-半胱氨酸(HOOC-PEG-COOH的3倍當(dāng)量)，37 ℃避光反應(yīng)5 h后加入蛋白酶(蛋白酶與PEG量比為1∶200)，4 ℃避光反應(yīng)16 h。反應(yīng)結(jié)束，透析24 h再超濾直至除盡未反應(yīng)的PEG和半胱氨酸，最后冷凍干燥得到修飾酶(SAV-PEG-L-cys)。前期研究[10]表明：蛋白酶成功與HOOC-PEG-COOH和L-半胱氨酸進(jìn)行共價(jià)連接，所得修飾酶體積是原酶的3.25倍，且具有還原二硫鍵的能力。

1.4 羊毛防氈縮整理

羊毛織物或纖維在pH值為8.0的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖溶液中，浴比為1∶25，溫度為40 ℃條件下加入 5 U/mL 蛋白酶Savinase、修飾后蛋白酶(SAV-PEG-L-cys)和與SAV-PEG-L-cys中等量的 L-半胱氨酸與蛋白酶混合物分別處理1～4 h。之后于85 ℃滅活10 min，水洗，晾干。

1.5 蛋白酶整理羊毛織物性能測(cè)定

1.5.1 氈縮率

取尺寸為15 cm×15 cm的織物，參照ISO 6330: 2012《紡織品家庭洗滌和干燥程序 紡織品測(cè)試》測(cè)試羊毛織物氈縮率，結(jié)果取3組平行試樣的平均值。

1.5.2 斷裂強(qiáng)力

織物尺寸為25 cm×5 cm，參照 GB/T 3923—1997《織物斷裂強(qiáng)力和斷裂伸長(zhǎng)率的測(cè)定》進(jìn)行織物強(qiáng)力測(cè)試，結(jié)果取3組平行試樣的平均值。

1.5.3 羊毛表面形貌觀察

羊毛纖維鍍金后，采用掃描電子顯微鏡觀察其表面形貌，電壓為5.00 kV，放大倍數(shù)為1 500。

1.5.4 接觸角

采用接觸角測(cè)試儀，向測(cè)試織物上滴1滴去離子水，測(cè)試100 s時(shí)接觸角數(shù)值。

1.5.5 阿爾瓦登反應(yīng)

取一小束不同酶處理的羊毛纖維于載玻片上，滴2滴飽和溴水，在顯微鏡下觀察并拍攝3 min后羊毛纖維的阿爾瓦登(Allworden)反應(yīng)，放大倍數(shù)為400。

1.5.6 羊毛酶解程度

采用著色法評(píng)定羊毛酶解程度。取一束不同酶處理的羊毛纖維，用冷凍包埋劑包埋放在 -20 ℃過(guò)夜，用冰凍切片機(jī)切成10 μm的薄片放于載玻片，之后用注射針滴加3滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005%的亞甲基藍(lán)溶液到羊毛纖維上，在顯微鏡下觀察并拍攝 3 min 后染料滲入纖維的情況[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 修飾酶處理對(duì)羊毛防氈縮效果的影響

本文考察了修飾蛋白酶SAV-PEG-L-cys處理對(duì)羊毛織物氈縮率和強(qiáng)力損失的影響，并與Savinase、SAV-PEG-L-cys 和等量的L-半胱氨酸/Savinase混合處理后織物性能進(jìn)行比較，結(jié)果如圖1所示。

圖1 處理時(shí)間對(duì)不同酶處理的羊毛織物氈縮率和強(qiáng)力損失的影響

Fig.1 Dimensional stability to felting(a) and strength loss(b) of wool fabrics treated with different proteases after different treatment time

圖2 不同酶處理后羊毛織物的接觸角(100 s)

Fig.2 Contact angles of wool fabrics at 100 s after different enzymatic treatments. (a) Raw wool; (b) Buffer treatment; (c) Savinase treatment; (d) L-cysteine/Savinase treatment; (e) SAV-PEG-L-cys treatment

從圖1(a)可以看出，隨著酶處理時(shí)間的延長(zhǎng)，織物氈縮率均呈下降趨勢(shì)。對(duì)于緩沖溶液處理樣，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，氈縮率逐漸下降，這是由于羊毛鱗片在堿性環(huán)境下會(huì)被溶解。而用蛋白酶Savinase處理羊毛織物時(shí)，半胱氨酸的加入使得織物氈縮率下降更明顯。這是因?yàn)榘腚装彼崮苓€原羊毛鱗片中角蛋白二硫鍵，使蛋白酶能更好地與羊毛接觸并強(qiáng)化其肽鍵水解作用。但是在等量的半胱氨酸和蛋白酶的條件下，SAV-PEG-L-cys處理樣在1、2 h 處理效果均不及L-半胱氨酸/Savinase處理樣，這是因?yàn)楹笳咧邪腚装彼岷偷鞍酌甘怯坞x的，作用范圍更廣。而處理3、4 h后，SAV-PEG-L-cys處理效果較好。其中，SAV-PEG-L-cys處理4 h織物的氈縮率與處理 3 h 相近，這說(shuō)明PEG分子的引入增大了蛋白酶的體積，空間位阻變大。因此，再延長(zhǎng)處理時(shí)間對(duì)氈縮率的影響不大[7]。此外，經(jīng)SAV-PEG-L-cys處理3 h的羊毛織物氈縮率(6.12%)最低，并且達(dá)到了可機(jī)洗標(biāo)準(zhǔn)。

由圖1(b)得知，隨著酶處理時(shí)間的延長(zhǎng)，織物強(qiáng)力損失率呈上升趨勢(shì)。對(duì)比蛋白酶Savinase處理樣和L-半胱氨酸/蛋白酶Savinase混合處理樣，半胱氨酸的加入使得羊毛強(qiáng)力損失更嚴(yán)重，這是因?yàn)榘腚装彼崮苓€原羊毛鱗片中的二硫鍵，加速了蛋白酶對(duì)羊毛的水解作用。但是在等量的半胱氨酸和蛋白酶的條件，SAV-PEG-L-cys處理樣的強(qiáng)力損失率比L-半胱氨酸/Savinase處理樣小得多，這是因?yàn)榈鞍酌附?jīng)修飾后，體積變大，在空間位阻作用下不能進(jìn)入纖維內(nèi)部，因此修飾酶對(duì)羊毛的水解只能作用在纖維表面，損傷較小[12]。

綜合考慮氈縮率和強(qiáng)力損失率2個(gè)影響因素，修飾酶處理時(shí)間以3 h最優(yōu)，即該條件下處理后羊毛織物的氈縮率為6.12%，強(qiáng)力損失率為11.7%。

2.2 修飾酶處理對(duì)羊毛潤(rùn)濕性能的影響

羊毛是一種集較強(qiáng)的疏水性和良好的吸濕性于一身的蛋白質(zhì)纖維，其疏水性是由纖維表面性質(zhì)(含疏水的類(lèi)脂結(jié)構(gòu))決定的，而吸濕性主要與其內(nèi)部親水性分子結(jié)構(gòu)有關(guān)[13]。測(cè)定羊毛織物潤(rùn)濕性可了解纖維表面類(lèi)脂層及鱗片結(jié)構(gòu)的破壞程度。圖2 示出不同酶處理后羊毛織物的接觸角。

由圖2可以看出，羊毛原樣接觸角為118.3°，表明羊毛表面的疏水性較強(qiáng)，主要是因?yàn)檠蛎[片表層的類(lèi)脂層結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的疏水性，且纖維間存在的靜止空氣也會(huì)一定程度地阻礙水滴的鋪展與滲透?？瞻讟拥慕佑|角有所下降，是因?yàn)閴A性緩沖溶液對(duì)類(lèi)脂結(jié)構(gòu)有一定的溶解作用。而Savinase處理樣與空白樣接觸角相近，這是由于蛋白酶對(duì)類(lèi)脂層沒(méi)有破壞作用，而類(lèi)脂層的存在也會(huì)阻礙蛋白酶對(duì)羊毛鱗片的作用。加入半胱氨酸后，接觸角下降明顯，降至95.9°，這是因?yàn)榘腚装彼崮軐Ⅶ[片層中的二硫鍵 —S—S— 斷裂，剝?nèi)ヒ徊糠诸?lèi)脂層，并且能使二硫鍵 —S—S— 還原成親水性的—SH。而對(duì)于SAV-PEG-L-cys處理樣的接觸角為107.5°，處理效果不及等量的半胱氨酸與蛋白酶聯(lián)合處理，這是因?yàn)榍罢唧w積較大，較難與鱗片層的接觸，而且修飾酶中半胱氨酸與蛋白酶是共價(jià)連接的，對(duì)鱗片層中的二硫鍵和酰胺鍵破壞范圍不及后者[10]。

2.3 修飾酶處理羊毛的Allworden反應(yīng)

Allworden反應(yīng)是考察羊毛鱗片結(jié)構(gòu)完整性的有效方法。羊毛纖維經(jīng)溴水處理后，其鱗片層的二硫鍵在溴水的氧化作用下會(huì)發(fā)生斷裂，形成親水性很強(qiáng)的磺酸基團(tuán)和少量的水溶性蛋白，從而出現(xiàn)鱗片層內(nèi)外滲透壓之差，水分向里滲透，形成泡狀物[14]；因此，在相同時(shí)間內(nèi)，可以根據(jù)纖維表面泡狀物的多少與氣泡大小來(lái)評(píng)判羊毛鱗片層破壞程度。圖3示出不同酶處理后羊毛纖維的Allworden效應(yīng)。

圖3 不同酶處理后羊毛纖維的Allworden效應(yīng)(×400)

Fig.3 Allworden reactions of wool fibers after different enzymatic treatments (×400). (a) Raw wool; (b) Buffer treatment; (c) Savinase treatment; (d) L-cysteine/Savinase treatment; (e) SAV-PEG-L-cys treatment

從圖3可以看出：原毛表面整齊地排列著一層密而大的氣泡，出現(xiàn)明顯的Allworden反應(yīng)；緩沖溶液處理樣相比原毛表面的氣泡稍微變少，說(shuō)明堿對(duì)纖維鱗片有輕微破損；與之相比，用蛋白酶Savinase處理的羊毛表面的氣泡也稍微減少，這是因?yàn)榈鞍酌改芩怩０锋I，羊毛鱗片有一定損傷；而在加入半胱氨酸后，L-半胱氨酸/Savinase處理樣表面幾乎沒(méi)有氣泡，說(shuō)明在半胱氨酸和蛋白酶的聯(lián)合作用下，鱗片中的二硫鍵和酰胺鍵被完全破壞，羊毛表面受損嚴(yán)重[14]；經(jīng)修飾酶SAV-PEG-L-cys處理的羊毛表面有較少氣泡，與L-半胱氨酸/Savinase處理樣相比，在半胱氨酸與蛋白酶含量相同的情況下，由于修飾酶是通過(guò)共價(jià)連接的，作用范圍不及分開(kāi)混合作用，但是與原酶相比，修飾酶對(duì)鱗片的損傷更大。

2.4 修飾酶處理對(duì)羊毛表面形態(tài)的影響

本文分別采用Savinase、SAV-PEG-L-cys和等量的L-半胱氨酸/Savinase混合處理羊毛織物，用掃描電子顯微鏡來(lái)觀察羊毛纖維表面形態(tài)的變化，并與未處理羊毛進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如圖4所示。

從圖4可看出：未處理羊毛鱗片完整，邊緣輪廓非常清晰。只有緩沖溶液處理的纖維的鱗片略有損傷，這是因?yàn)閴A性緩沖液對(duì)羊毛有一定的溶解作用；對(duì)于蛋白酶Savinase處理的羊毛纖維，鱗片邊緣輪廓不太清晰，纖維鱗片有一定損傷，經(jīng)過(guò)半胱氨酸和Savinase蛋白酶聯(lián)合處理樣，鱗片破壞嚴(yán)重，說(shuō)明半胱氨酸的加入加強(qiáng)了蛋白酶對(duì)鱗片的水解作用。再對(duì)比圖4中(d)和(e)，在半胱氨酸與蛋白酶用量相同的條件下，修飾酶SAV-PEG-L-cys對(duì)纖維鱗片損傷較輕，表面較為光滑，與前面所得到的氈縮率和強(qiáng)力損失率結(jié)果一致，這是因?yàn)樾揎椕阁w積增大，不能進(jìn)入纖維內(nèi)部而只作用羊毛鱗片。

圖4 不同酶處理3 h后的羊毛纖維的SEM照片(×1 500)

Fig.4 SEM images of wool fabrics after different enzymatic treatments for 3 h(×1 500). (a) Raw wool; (b) Buffer treatment; (c) Savinase treatment; (d) L-cysteine/Savinase treatment; (e) SAV-PEG-L-cys treatment

2.5 羊毛纖維酶解深度分析

羊毛纖維中半胱氨酸?；恤然蛶€基以及蛋白酶水解肽鏈時(shí)產(chǎn)生的羧基在pH值大于7.0時(shí)均帶負(fù)電荷，因此，還原劑和蛋白酶在羊毛中的作用程度可以通過(guò)堿性陽(yáng)離子染料亞甲基藍(lán)染料著色強(qiáng)度與分布加以評(píng)定[11]，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同酶處理酶對(duì)羊毛的破壞程度照片(×400)

Fig.5 Photographs of wool fibers after different enzymatic treatments (×400). (a) Raw wool; (b) Buffer treatment; (c) Savinase treatment; (d) L-cysteine/Savinase treatment; (e) SAV-PEG-L-cys treatment

原毛和緩沖溶液處理樣都沒(méi)有染料滲入，而經(jīng)過(guò)Savinase蛋白酶處理后的羊毛內(nèi)部有染料滲入。這是因?yàn)榈鞍酌改芡ㄟ^(guò)CMC進(jìn)入羊毛內(nèi)部皮質(zhì)層并產(chǎn)生水解作用，釋放游離羧基負(fù)離子，與陽(yáng)離子染料(亞甲基藍(lán))結(jié)合，由此說(shuō)明蛋白酶對(duì)羊毛纖維內(nèi)部有一定的水解破壞。而對(duì)于L-cysteine/Savinase處理樣，染料幾乎覆蓋整個(gè)纖維內(nèi)部，說(shuō)明半胱氨酸的加入增強(qiáng)了蛋白酶對(duì)羊毛的水解作用，羊毛損傷嚴(yán)重，與上述結(jié)論相同。相比圖5(d)和(e)，在等量的半胱氨酸與蛋白酶以及染色時(shí)間相同的條件下，經(jīng)修飾酶SAV-PEG-L-cys處理的羊毛纖維，滲入的染料要少得多，且主要集中在羊毛外部鱗片層而沒(méi)有進(jìn)入皮質(zhì)層。這說(shuō)明修飾酶基本不破壞羊毛纖維的主體結(jié)構(gòu)，只作用在鱗片層。這種表面定域催化作用是由于PEG分子的引入增大了蛋白酶的分子體積使其不能通過(guò)纖維內(nèi)部皮質(zhì)層，而只能作用表面鱗片層。

3 結(jié) 論

1) 通過(guò)探究修飾酶處理對(duì)羊毛防氈縮效果的影響，確定修飾酶整理最佳時(shí)間為3 h，其氈縮率為6.12%，達(dá)到機(jī)可洗標(biāo)準(zhǔn)，其強(qiáng)力損失為11.7%；而未修飾蛋白酶處理的織物的氈縮率均未達(dá)到“機(jī)可洗”標(biāo)準(zhǔn)且強(qiáng)力損失均高于修飾蛋白酶。

2) 通過(guò)接觸角測(cè)試、Allworden反應(yīng)、SEM觀察以及著色法等實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證明修飾蛋白酶只作用羊毛鱗片層，通過(guò)半胱氨酸還原二硫鍵，蛋白酶水解肽鍵，達(dá)到破壞鱗片而不損傷纖維主體結(jié)構(gòu)的作用。

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