陳卓君，魏銘，林果，陳昱锜，梁杉，張柏林，朱保慶*

1(林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))，北京，100083) 2(中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院，北京，102209) 3(北京工商大學(xué),北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心，北京，100048)

發(fā)酵食品是以農(nóng)產(chǎn)品、林產(chǎn)品和畜產(chǎn)品等為原料，利用微生物(不包含食品中直接加入的有益微生物)發(fā)酵而成的一類(lèi)特殊食品。發(fā)酵食品最初是以延長(zhǎng)食品保質(zhì)期、拓展食品在不同季節(jié)的可食性為目的；因其具有獨(dú)特的風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，近年越來(lái)越受到消費(fèi)者的歡迎[1]。微生物作為發(fā)酵食品的“靈魂”，與發(fā)酵食品的品質(zhì)直接相關(guān)，在提高產(chǎn)品貯藏期、富集功能因子和保障安全等方面都發(fā)揮著不可替代的作用[2]。因此，準(zhǔn)確計(jì)數(shù)發(fā)酵食品中的不同微生物，是研究發(fā)酵食品品質(zhì)形成機(jī)理以及工藝改進(jìn)和產(chǎn)品質(zhì)量控制的基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)的微生物計(jì)數(shù)方法為菌落計(jì)數(shù)法，該方法易受主觀影響，繁瑣復(fù)雜，耗時(shí)耗力，存在較大誤差，既無(wú)法區(qū)分“可生存但不可培養(yǎng)”(viable but non-culturable,VBNC)狀態(tài)下細(xì)胞也無(wú)法對(duì)復(fù)雜菌系中的單一菌種進(jìn)行有效定量。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，高靈敏度和特異性的實(shí)時(shí)熒光定量PCR (quantitative real-time PCR，qPCR)也被開(kāi)發(fā)用于發(fā)酵食品的微生物計(jì)數(shù)[3]，該方法的主要缺陷在于難以區(qū)分死菌和活菌，使得死菌中存留的大量DNA也可被擴(kuò)增，導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果出現(xiàn)偏差[4]。近年來(lái)出現(xiàn)的疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)偶聯(lián)qPCR技術(shù)，可以有效避免常規(guī)qPCR的缺陷，也可檢測(cè)VBNC狀態(tài)的微生物。目前，該技術(shù)在發(fā)酵食品中已被用于多種發(fā)酵常見(jiàn)微生物的計(jì)數(shù)。本文系統(tǒng)地綜述了PMA-qPCR技術(shù)的原理、影響因素及在常見(jiàn)發(fā)酵食品中應(yīng)用現(xiàn)狀，同時(shí)提出了該技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展和拓展應(yīng)用的展望。

1 PMA-qPCR方法介紹

1.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)原理及特點(diǎn)

qPCR是在標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，使用熒光報(bào)告基團(tuán)(包括雙鏈DNA結(jié)合染料或在擴(kuò)增過(guò)程中摻入PCR產(chǎn)物的、與PCR引物或探針結(jié)合的染料分子)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，利用具有熱循環(huán)功能及熒光染料篩查能力的儀器，每次循環(huán)結(jié)束后通過(guò)熒光染料檢測(cè)DNA含量，熒光染料產(chǎn)生的熒光信號(hào)與生成的PCR產(chǎn)物分子(擴(kuò)增片段) 數(shù)成正比。利用反應(yīng)指數(shù)期采集的數(shù)據(jù)，生成有關(guān)擴(kuò)增靶點(diǎn)起始量的精度極高的定量信息。與傳統(tǒng)PCR相比，熒光定量PCR具有特異性更強(qiáng)、靈敏度更高、檢測(cè)周期更短、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在微生物計(jì)數(shù)方面得到了廣泛的應(yīng)用[5]。然而微生物在自然環(huán)境中以多種生理狀態(tài)存在：可培養(yǎng)的活菌，活的非可培養(yǎng)狀態(tài)，具有完整結(jié)構(gòu)但無(wú)生物活性的死菌以及膜損傷死菌。qPCR技術(shù)雖能克服傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法無(wú)法檢測(cè)VBNC狀態(tài)下細(xì)胞的缺陷，但無(wú)法區(qū)分死活菌DNA，這對(duì)活菌計(jì)數(shù)帶來(lái)巨大的挑戰(zhàn)[6]。

1.2 PMA-qPCR檢測(cè)活菌的機(jī)理

膜損傷細(xì)胞沒(méi)有代謝活性，適宜條件下培養(yǎng)難以恢復(fù)生長(zhǎng)，因此將膜完整性作為評(píng)判活菌標(biāo)準(zhǔn)已被多數(shù)學(xué)者接受[7]?；诨罹織l件，疊氮溴化丙錠(propidiummonoazide，PMA)常被用于qPCR的前處理步驟[8]，待測(cè)菌與適宜濃度PMA避光條件下孵育一定時(shí)間，經(jīng)光鈍化后即可提取活菌DNA。

PMA是一種具有高親和力的光敏性DNA結(jié)合染料，如圖1所示，該染料自身熒光弱，與核酸結(jié)合后熒光信號(hào)大大增強(qiáng)。在DNA提取之前將PMA與待測(cè)樣品混合，PMA會(huì)選擇性的進(jìn)入膜損傷細(xì)胞并嵌入雙鏈DNA結(jié)構(gòu)中，每分子染料可與4～5個(gè)核苷酸相結(jié)合。在可見(jiàn)光(最大吸收峰為464 nm)作用下，PMA分子中疊氮基團(tuán)分解產(chǎn)生高活性的氮烯類(lèi)化合物，與DNA分子發(fā)生共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)生成沉淀，進(jìn)而抑制膜損傷細(xì)胞qPCR過(guò)程中DNA的擴(kuò)增。溶液中殘留的過(guò)量染料與水分子經(jīng)光照反應(yīng)生成羥胺化合物，進(jìn)而失去交聯(lián)活性，不會(huì)影響后續(xù)活細(xì)胞DNA擴(kuò)增[8]。利用PMA選擇滲透性和qPCR特異性，能夠顯著提高檢測(cè)速度和靈敏度。

圖1 PMA與DNA反應(yīng)原理示意圖[9]Fig.1 Schematic diagram for the reaction bewteen PMA and DNA

2 影響PMA-qPCR檢測(cè)效率的因素

2.1 目標(biāo)微生物

表1匯總了利用qPCR對(duì)常見(jiàn)發(fā)酵微生物計(jì)數(shù)的目的基因、引物序列等信息，諸多學(xué)者針對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株會(huì)選擇不同目的基因，細(xì)菌通常采用16S rDNA編碼基因，而26S rDNA及ITS編碼基因常用于酵母的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)。

表1 不同微生物qPCR檢測(cè)目的基因的選取及引物列表Table 1 Selected genes and related primers used in qPCR for different microorganisms

續(xù)表1

微生物 引物 目的基因 擴(kuò)增長(zhǎng)度/bp引物序列(5’-3’) 參考文獻(xiàn)Tet_R107AATCAACACCAACCGAGAATCC[38]真菌ITS1qITS2ITS1-5.8SrDNA-ITS2290TCCGTAGGTGAACCTGCGGTTYGCTGYGTTCTTCATCG[16] [17]酵母YEAST-F26S rDNA124GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGC[18]YEAST-RTCTCTTTCCAAAGTTCTTTTCATCTTT[18]釀酒酵母CESP-FSCER-RITS2 和5.8S rDNA175ATCGAATTTTTGAACGCACATTGCGCAGAGAAACCTCTCTTTGGA[18][18]布魯氏酒香酵母DekITSITS308GACACGTGGAATAAGCAAGG[24]BruxITRATTATCCCCTCACTCCCCTC[24]葡萄有孢漢生酵母CESP-FHUV-RITS2和5.8S rDNA121ATCGAATTTTTGAACGCACATTGAACCCTGAGTATCGCCCACA[24][24]釀酒酵母SC1dSC1rRAPD bands301ACATATGAAGTATGTTTCTATATA-ACGGTGTGGTGCTGGTGCGGATCTA[18][18]

研究表明[10]，對(duì)不同微生物進(jìn)行PMA處理時(shí)應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，目標(biāo)菌種不同(特別是革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)差異)可能對(duì)DNA活性染料效果有很大影響。革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁含有外膜，而革蘭氏陽(yáng)性菌主要為肽聚糖層[4]，這種差異使PMA可以更快滲透入膜損傷的革蘭氏陰性菌，如果兩種細(xì)菌存在于同一環(huán)境樣本中，最終可能產(chǎn)生群落定量偏差[11]。值得指出的是，現(xiàn)階段研究多針對(duì)于細(xì)菌，對(duì)真菌和病毒的描述較少。同時(shí)為了正確地描述食品生態(tài)系統(tǒng)中的微生物種群，需要考慮的重要因素之一是待擴(kuò)區(qū)域的選擇。目標(biāo)基因必須有2個(gè)基本特征: (1)存在于待檢測(cè)的微生物組的所有成員中；(2)具有可設(shè)計(jì)通用引物的保守區(qū)域和可分化的可變區(qū)域[12]。針對(duì)目的基因進(jìn)行正確的引物設(shè)計(jì)也至關(guān)重要，LAI等[13]基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔基因和23S rDNA基因，設(shè)計(jì)了格氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)和唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)特異性引物，從而可以有效計(jì)數(shù)益生菌產(chǎn)品中兩種乳酸菌活細(xì)胞值。

2.2 PMA處理?xiàng)l件

除待測(cè)菌自身差異外，PMA處理?xiàng)l件也是影響擴(kuò)增效果的重要因素，關(guān)鍵點(diǎn)包括：PMA濃度、暗反應(yīng)時(shí)間、光反應(yīng)時(shí)間[14-19]，三者需要針對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行平衡優(yōu)化(表2)。

PMA濃度應(yīng)以能夠最大程度抑制死菌，同時(shí)不影響活菌的后續(xù)定量為先決條件。TANTIKACHORNKIAT等[20]在研究中推測(cè)PMA的最佳濃度可能與細(xì)胞密度有關(guān)：細(xì)胞密度越高，則需要更高的PMA濃度才能有效抑制死菌DNA的擴(kuò)增。有研究表明密度處于106～107CFU/mL的酵母和密度近似108CFU/mL的細(xì)菌得到準(zhǔn)確定量結(jié)果的條件均為6 μmol/L PMA。

表2 針對(duì)不同微生物PMA處理?xiàng)l件優(yōu)化Table 2 The optimal conditions of the PMA treatments for different microorganisms

暗反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短決定了PMA嵌入DNA的充分程度，嵌入DNA的PMA在強(qiáng)光照射下與DNA共價(jià)交聯(lián)，未反應(yīng)PMA則被鈍化，光反應(yīng)時(shí)間決定后續(xù)活菌DNA擴(kuò)增效率。ANDORR等[21]測(cè)定釀酒酵母時(shí)發(fā)現(xiàn)使用6 μmol/L PMA處理樣品，進(jìn)行10 min暗反應(yīng)后采用兩次相隔1 min的30秒曝光方法定量結(jié)果更為準(zhǔn)確。SHAO等[22]使用了20 μmol/L PMA進(jìn)行20 min光鈍化，可有效檢測(cè)德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckiissp.)是否進(jìn)入VBNC狀態(tài)，這與NOCKER等[8]針對(duì)純凈環(huán)境培養(yǎng)細(xì)菌優(yōu)化后的處理?xiàng)l件有所不同。

3 PMA-qPCR計(jì)數(shù)在發(fā)酵食品中的應(yīng)用

3.1 酒

釀酒是一種復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，受到多種微生物和環(huán)境因素的影響，如何對(duì)酒樣中微生物定性定量，對(duì)工藝控制及成品酒貯存至關(guān)重要?，F(xiàn)階段以此方法進(jìn)行酒類(lèi)研究較少，主要集中于葡萄酒。釀造中，隨著主要發(fā)酵產(chǎn)物乙醇濃度的增加，酒樣中細(xì)胞的膜流動(dòng)性受到影響，對(duì)膜蛋白產(chǎn)生毒性，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致死亡[23]。ANDORR[21]推測(cè)，發(fā)酵過(guò)程中高濃度酒精導(dǎo)致死菌大規(guī)模的出現(xiàn)，可能會(huì)對(duì)活菌定量產(chǎn)生影響；在實(shí)驗(yàn)中添加106個(gè)/mL膜損傷菌進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，過(guò)量死亡細(xì)胞的存在并未干擾到菌群密度為103～107CFU/mL酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié)果。將優(yōu)化后的PMA處理?xiàng)l件用于發(fā)酵酒及陳釀酒中總酵母、釀酒酵母、非釀酒酵母和腐敗酵母的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同生理狀態(tài)下酵母均可被快速定量。同時(shí)在不同葡萄酒酒樣中利用Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，應(yīng)考慮基質(zhì)的影響。RIZZOTTI等[24]在檢測(cè)10種葡萄酒中酵母、乳酸菌及醋酸菌密度時(shí)，針對(duì)不同基質(zhì)制作了相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，大幅降低環(huán)境因素對(duì)結(jié)果的影響。

PMA-qPCR技術(shù)在其他酒類(lèi)中也有應(yīng)用，VENDRAME等[25]以布魯氏酒香酵母(Brettanomycesbruxellensis)為目標(biāo)菌株，建立起了一套能夠在9 h快速檢測(cè)酒樣中是否存在腐敗酵母的方法，檢測(cè)限在紅酒、白酒、啤酒中分別為0.83、0.63、0.23 lg CFU/mL。中國(guó)傳統(tǒng)真菌發(fā)酵米酒中，LV[26]優(yōu)化了對(duì)于釀酒酵母(S.cerevisiae)，植物乳桿菌(L.plantarum)和紫紅曲霉((M.purpureus)的PMA處理?xiàng)l件，同時(shí)對(duì)qPCR、PMA-qPCR、RT-qPCR處理結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)PMA-qPCR與傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法最為擬合，同時(shí)檢測(cè)限較低，據(jù)此建立了監(jiān)控米酒發(fā)酵過(guò)程中整體菌群動(dòng)態(tài)變化的高效途徑。

3.2 發(fā)酵乳

發(fā)酵乳是乳和乳制品在發(fā)酵菌的作用下發(fā)酵而成的酸性凝乳狀制品，主要包括酸奶、奶酪及開(kāi)菲爾等。發(fā)酵乳常被用于引入除發(fā)酵劑外益生菌的載體，益生菌是一種通過(guò)改善腸道微生物平衡從而對(duì)宿主施加有益影響的微生物添加物，乳桿菌和雙歧桿菌是發(fā)酵乳生產(chǎn)中常使用的兩種益生菌，用于改進(jìn)發(fā)酵乳的口感、質(zhì)地等感官特性，增強(qiáng)發(fā)酵乳的健康性能[27]。國(guó)際食品法典標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳卷[28](CODEX STAN 243—2003) 中規(guī)定在最低保質(zhì)期內(nèi)發(fā)酵乳中發(fā)酵微生物應(yīng)是大量存活的，在除了用于發(fā)酵的特定發(fā)酵劑之外，發(fā)酵乳中微生物的計(jì)數(shù)至少要有106CFU /g。所以在發(fā)酵乳的生產(chǎn)和保存中微生物的存活率有直接影響。

3.2.1 酸奶

酸奶主要是以新鮮牛乳為原料，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵形成的風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富的功能性乳制品。酸奶是益生菌最常見(jiàn)且經(jīng)濟(jì)的載體，在傳統(tǒng)發(fā)酵劑基礎(chǔ)上，發(fā)展益生菌酸奶可有效解決耐藥菌株問(wèn)題，同時(shí)滿足人民對(duì)健康食品的不斷需求[29]。以混合菌株作為發(fā)酵劑是增強(qiáng)酸奶益生性的較優(yōu)方法，GARCA-CAYUELA等[30]利用PMA-qPCR檢測(cè)了貨架期內(nèi)(28 d)及超出貨架期30和60 d的酸奶樣品中種水平上嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)STY-31、德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp. bulgaricus)LBY-27、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)LA-5、干酪乳桿菌干酪亞種(Lactobacilluscaseisubsp.casei)LC-01 和雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)BB-12的動(dòng)態(tài)變化；結(jié)果發(fā)現(xiàn), PMA-qPCR可以在設(shè)計(jì)了種間特異性引物的基礎(chǔ)上，在復(fù)雜微生物環(huán)境條件中做到105CFU/mL菌濃度檢測(cè)范圍內(nèi)的簡(jiǎn)單快速計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)中不會(huì)出現(xiàn)交叉污染現(xiàn)象，菌株的生存能力在貨架期后才會(huì)減弱。目的基因的選擇與特異性引物的設(shè)計(jì)在定量微生物方法中的重要性也被SCARIOT等[31]進(jìn)一步證實(shí)，利用PMA-qPCR檢測(cè)副干酪乳桿菌(L.paracasei)ATCC 10746的tuf基因，觀察其在純凈環(huán)境和酸奶發(fā)酵過(guò)程中的生存狀況，得到不同基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)曲線平均效率為94%和96% (R2> 0.98)，兩個(gè)樣本的檢測(cè)限(LOD)均為104CFU/mL。將發(fā)酵1和30 d的酸奶進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)菌株仍保持在108CFU/mL，qPCR方法得到的計(jì)數(shù)值高于PMA-qPCR。這些研究證明PMA-qPCR技術(shù)可用于在復(fù)雜酸奶發(fā)酵環(huán)境中快速定量益生菌，幫助生產(chǎn)者選取生存能力更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)菌株。

3.2.2 奶酪

奶酪同樣是一種以混合發(fā)酵劑發(fā)酵的食品，作為益生菌的優(yōu)良載體，具有獨(dú)特的風(fēng)味和質(zhì)地。PMA-qPCR技術(shù)已被用于監(jiān)控切打干酪(chadder cheese)發(fā)酵過(guò)程中益生菌生長(zhǎng)情況，éMILIE[32]探究了添加3種益生菌對(duì)車(chē)打干酪發(fā)酵及成熟期的影響，樣品以乳酸乳球菌為發(fā)酵劑，分別添加雙歧桿菌(B.animalissubsp. lactis)BB-12、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)RO011、瑞士乳桿菌(L.helveticus)RO052和3種益生菌混合物，結(jié)果表明,益生菌添加會(huì)影響發(fā)酵菌株的生長(zhǎng)，混合菌株之間雖存在抑制作用，但在成熟期奶酪中仍能保持較高活性(lg 9 CFU/g)。除此之外，也有學(xué)者使用PMA-qPCR技術(shù)與體外模擬實(shí)驗(yàn)相結(jié)合從而得出比培養(yǎng)依賴(lài)型定量更為高效的方法。VILLARREAL等[33]使用qPCR、PMA-qPCR結(jié)合平板計(jì)數(shù)法評(píng)價(jià)了嗜酸乳桿菌La-5、雙歧桿菌BB-12和清酒乳桿菌(L.sakeisubsp. sakei)2a在小瑞士奶酪貨架期間的存活率，發(fā)現(xiàn)3種方法在測(cè)定初期沒(méi)有較大差異，然而隨著體外誘導(dǎo)試驗(yàn)的變化，不同方法之間差異增大，電鏡結(jié)果顯示qPCR計(jì)數(shù)了大量膜損傷細(xì)胞而PMA-qPCR克服了這個(gè)問(wèn)題。在檢測(cè)中顯示BB-12菌株有較好的生存能力，能夠維持在6 lgCFU/g及以上。基于這些研究，ERKUS等[34]發(fā)掘了PMA-qPCR更大的應(yīng)用潛力，以8種混合菌株為發(fā)酵劑的GUODA干酪在成熟過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)大量膜不完整細(xì)胞，這給宏基因組帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)，用PMA處理發(fā)酵期和成熟期樣品后選擇性剔除了膜損傷細(xì)胞，從而可以對(duì)奶酪微生物群落中活細(xì)胞進(jìn)行更高效的宏基因組鑒別分析。

3.2.3 開(kāi)菲爾

開(kāi)菲爾(Kefir)是一種利用開(kāi)菲爾粒(Kefir grain)，對(duì)牛奶、羊奶等發(fā)酵，得到的含醇、酸及少量CO2的發(fā)酵乳。開(kāi)菲爾粒是一種天然存在的混菌發(fā)酵體系，內(nèi)含多種微生物，分析其菌相組成是探討發(fā)酵過(guò)程、代謝機(jī)制及確保發(fā)酵乳安全性的前提[35]。PORCELLATO等[36]將PMA-qPCR技術(shù)與變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)及自動(dòng)核糖體間隔基因分析(automated Ribosomal intergenic spacer analysis，ARISA)聯(lián)用，探究了3個(gè)生產(chǎn)批次的開(kāi)菲爾產(chǎn)品在貨架期及超過(guò)貨架期兩周內(nèi)的菌群動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明在儲(chǔ)存過(guò)程中，PMA處理后的Kefir樣品與原始樣品中菌群存在顯著差異，作為發(fā)酵劑的主要構(gòu)成菌株鏈球菌屬(Streptococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)和乳桿菌屬(Lactobacillus)濃度明顯下降，DGGE及ARISA檢測(cè)不同批次樣品中均出現(xiàn)了污染微生物。這種直接從食品中提取DNA進(jìn)行分析的方法為開(kāi)菲爾類(lèi)發(fā)酵產(chǎn)品的研究提供了新的思路。

3.3 魚(yú)露

魚(yú)露因富含谷氨酸而被作為食品中天然的增鮮劑。它以低值魚(yú)蝦或水產(chǎn)品加工下腳料為原料，利用環(huán)境、魚(yú)自身的酶系及耐鹽酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等微生物在一定條件下發(fā)酵而成[37]。因其自然發(fā)酵周期較長(zhǎng)(12～18個(gè)月)，生產(chǎn)中通常采用添加發(fā)酵劑的形式加速發(fā)酵和提高產(chǎn)品品質(zhì)，所以監(jiān)測(cè)添加菌種的生長(zhǎng)變化對(duì)于發(fā)酵過(guò)程的質(zhì)控是必要的。為了快速檢測(cè)出富含28株原生菌株的復(fù)雜初始發(fā)酵環(huán)境中添加發(fā)酵劑的生長(zhǎng)情況，UDOMSIL等[38]使用基于目標(biāo)菌株堿性絲氨酸蛋白酶X基因(aprX)及內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行精確定量，在優(yōu)化后的PMA處理?xiàng)l件下，對(duì)嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌(Virgibacillussp.)SK37和嗜鹽四生球菌(Tetragenococcus.halophilus) MS33的最低限可達(dá)到103、102CFU/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)PMA-qPCR檢測(cè)的穩(wěn)定性未受到復(fù)雜基質(zhì)的影響，所以可被用于監(jiān)測(cè)發(fā)酵劑發(fā)酵過(guò)程的實(shí)用工具(表3)。

表3 不同發(fā)酵食品活菌檢測(cè)線性范圍及最低檢測(cè)限Table 3 The detection limits of PMA-qPCR technique for enumeration of living microbes in different fermentation foods

4 展望

PMA-qPCR技術(shù)是近年來(lái)較為新型的微生物計(jì)數(shù)技術(shù)，以其較高的工作效率和準(zhǔn)確的定量結(jié)果受到很多學(xué)者的青睞。本文綜述了近年來(lái)PMA-qPCR技術(shù)在發(fā)酵食品科研領(lǐng)域的應(yīng)用情況；值得注意的是，由于特定發(fā)酵食品內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性和特異性，在實(shí)際應(yīng)用中需針對(duì)相應(yīng)的食品基質(zhì)進(jìn)行PMA反應(yīng)條件優(yōu)化。