金紅星，王星，彭鈺瑋

(河北工業(yè)大學 化工學院，天津，300130)

甘露醇(mannitol)是一種具有多種功效的六糖醇，被廣泛地應用于醫(yī)藥、食品、化工和電子等行業(yè)[1]。目前生產(chǎn)甘露醇的4種方法中，海藻提取法產(chǎn)生大量廢水、能耗高、污染嚴重；催化加氫法在高溫高壓、金屬催化和通氫氣條件下進行且產(chǎn)物分離困難[2]；酶轉(zhuǎn)化法需要昂貴的輔酶；微生物發(fā)酵法產(chǎn)甘露醇綠色清潔，是產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級的迫切需要。產(chǎn)甘露醇的細菌、酵母和絲狀真菌中，進行異型乳酸發(fā)酵的細菌(lactic acid bacteria, LAB)比較出色[1]。明串珠菌(Leuconostoc)、酒球菌(Oenococcus)和乳桿菌(Lactobacillus)等[3]異型乳酸發(fā)酵細菌，將果糖底物轉(zhuǎn)化為甘露醇。國內(nèi)外的很多學者[4-8]研究了產(chǎn)甘露醇的發(fā)酵工藝。然而，南京工大的ZHANG等[9]認為，發(fā)酵法產(chǎn)甘露醇途徑經(jīng)濟效益低的原因是發(fā)酵培養(yǎng)基成本高、果糖的滲漏而進入中心代謝、甘露醇產(chǎn)率低。因此，本課題組[10-11]通過多基因敲除、mdh(甘露醇脫氫酶)基因敲入改造了染色體，并考察了對腸膜明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的影響，以相對廉價的蔗糖作為底物時，產(chǎn)率已經(jīng)達到90%以上。

為進一步提高底物到目的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率，在腸膜明串珠菌中擬引入同型乳酸發(fā)酵細菌產(chǎn)甘露醇的代謝途徑，即葡萄糖→葡萄糖-6-磷酸→果糖-6-磷酸→甘露醇-1-磷酸→甘露醇[1, 12]。明串珠菌的PPK(戊糖磷酸解酮酶)代謝途徑存在2種酶的編碼基因，即催化葡萄糖→葡萄糖-6-磷酸的葡萄糖激酶和催化葡萄糖-6-磷酸→果糖-6-磷酸的磷酸葡萄糖異構(gòu)酶[13]。因此，只要引入催化果糖-6-磷酸→甘露醇-1-磷酸的甘露醇-1-磷酸脫氫酶基因(mt1d)和催化甘露醇-1-磷酸→甘露醇的甘露醇-1-磷酸酶基因(m1p)，就可以在明串珠菌中構(gòu)建由葡萄糖轉(zhuǎn)化為甘露醇的體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)CGMCC1.10327、大腸桿菌(E.coli)DH5α、質(zhì)粒pUC19，均由本實驗室保存；腸膜明串珠菌ATCC8293、植物乳桿菌CGMCC1.2437、食淀粉乳桿菌(Lactobacillusamylovorus)CGMCC1.3395，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑

高保真的DNA聚合酶、T4DNA連接酶：謙泰生物技術(shù)有限公司；PCR純化試劑盒：Axygen公司；限制性內(nèi)切酶：大連寶生物工程有限公司；氨芐青霉素：Sbase公司。引物由金唯智生物科技有限公司合成(表1)，m1p基因編碼序列由生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

大腸桿菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 ℃；腸膜明串珠菌和植物乳桿菌用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30 ℃。

1.1.4 儀器與設(shè)備

Mastercycler?nexus PCR儀，Eppendorf;Gene Pluser XcellTM電轉(zhuǎn)化儀，Bio-Rad；LC-20AD CTO-20A高效液相色譜儀,Agilent。

1.2 方法

1.2.1mt1d-m1p串聯(lián)體的合成

以植物乳桿菌染色體DNA為模板，利用1對引物mt1d1/mt1d2 PCR擴增mt1d編碼序列；以腸膜明串珠菌ATCC8293染色體DNA為模板，利用1對引物ldhA1/ldhA2 PCR擴增D-ldh基因的表達元件；通過重疊延伸PCR將D-ldh基因表達元件和mt1d編碼序列連接成為mt1d基因表達盒。

根據(jù)GenBank中登錄號為AF032462的柔嫩艾美球蟲(Eimeriatenella)的m1p編碼序列，按照明串珠菌染色體的密碼子偏好性優(yōu)化了核苷酸序列，并委托公司人工合成了DNA序列。利用2對引物ldhA3/ldhA4、m1p1/m1p2，通過重疊延伸PCR合成了m1p基因表達盒。

利用1對引物mt1de1/mt1de2 PCR擴增獲得的mt1d基因表達盒序列插入到pUC19的EcoRI和XbaI位點上，命名為pUC19-mt1d。利用1對引物m1pe1/m1pe2 PCR擴增獲得的m1p基因表達盒序列插入到pUC19-mt1d的KpnI位點上，成為mt1d-m1p表達盒串聯(lián)體。

1.2.2 同源重組載體的構(gòu)建

利用2對引物dtsq1/dtsq2、dtsh1/dtsh2，通過重疊延伸PCR獲得的產(chǎn)物插入到pUC19的EcoRI和HindⅢ位點上，成為中間帶有XbaI識別序列的葡聚糖蔗糖酶基因的同源重組載體。

利用2對引物aldhq1/aldhq2、aldhh1/aldhh2，通過重疊延伸PCR獲得的產(chǎn)物插入到pUC19的EcoRI和HindⅢ位點上，成為中間帶有XbaI識別序列的乙醛脫氫酶基因的同源重組載體。

以食淀粉乳桿菌染色體DNA為模板，利用1對引物amyl/amyr通過PCR獲得的產(chǎn)物插入到同源重組載體XbaI位點上，成為中間帶有α-淀粉酶基因標記的同源重組載體。

以mt1d-m1p表達盒串聯(lián)體為模板，利用1對引物mtmpl/ mtmpr通過PCR獲得的產(chǎn)物插入到同源重組載體的XbaI位點上，成為中間帶有mt1d-m1p表達盒串聯(lián)體的同源重組載體。

1.2.3 突變菌株的構(gòu)建和驗證

參照文獻[15]的方法進行明串珠菌的電擊轉(zhuǎn)化。通過2次同源重組獲得mt1d-m1p表達盒串聯(lián)體定點插入到染色體的突變菌株。第1次同源重組：用中間帶有α-淀粉酶基因標記的同源重組載體轉(zhuǎn)化初始菌株，在平板上獲得藍色的目的菌株，即靶基因失活、帶有標記基因的菌株。第2次同源重組：用中間帶有mt1d-m1p表達盒串聯(lián)體的同源重組載體轉(zhuǎn)化第1次同源重組獲得的目的菌株，在平板上獲得白色的目的菌株，即靶基因失活、定點插入mt1d-m1p表達盒串聯(lián)體的菌株。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in this study

以染色體DNA為模板，利用1對引物aldhyq/aldhyh進行PCR，通過瓊脂糖凝膠電泳驗證aldh基因失活、帶有標記基因的菌株(Δaldh::amy)和aldh基因失活、定點插入mt1d-m1p表達盒串聯(lián)體的菌株[Δaldh::(mt1d-m1p)]。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)甘露醇

野生型菌株和突變菌株用發(fā)酵培養(yǎng)基[14-15]進行搖瓶發(fā)酵20 h，用HPLC測定甘露醇含量。參照文獻[16-17]改進的檢測條件：檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD 6000)，色譜柱為Ultimate XB-NH2，流動相為V(乙腈) ∶V(水)=85∶15，流動相流速為：1 mL/min，柱溫為40 ℃，漂移管溫度為95 ℃，氣流流速為3L/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 mt1d-m1p串聯(lián)體的合成

第1輪PCR擴增得到了預期長度為177 bp的D-ldh基因表達元件和1 164 bp的mt1d編碼序列(圖1-A，圖1-B)。第2輪PCR通過2個第1輪PCR產(chǎn)物末端的反向互補序列相互退火結(jié)合，構(gòu)建成D-ldh基因表達元件和mt1d編碼序列連接在一起的DNA融合體。但是此時該融合體的量比較少，經(jīng)過第3輪PCR特異性地擴增，成功得到了預期為1 341 bp的mt1d基因表達盒(圖1-C)。

M-Marker；1和2-D-ldh基因表達元件；3-mt1d編碼序列；4和5-mt1d表達盒。圖1 合成mt1d表達盒的重疊延伸PCRFig.1 Overlapping extension PCR for the synthesis of mt1d expression cassette

第1輪PCR擴增得到了預期長度為177 bp的D-ldh基因表達元件和946 bp的m1p編碼序列(圖2-A，圖2-B)。

M-Marker；1和2-D-ldh基因表達元件；3和4-m1p編碼序列；5-m1p表達盒圖2 合成m1p表達盒的重疊延伸PCRFig.2 Overlapping extension PCR for the synthesis ofm1p expression cassette

第2輪PCR利用2個第1輪PCR產(chǎn)物末端的反向互補序列相互退火結(jié)合，并通過8輪循環(huán)使2個DNA片段重疊延伸，經(jīng)過第3輪PCR特異性地擴增，成功得到了預期為1 107 bp的m1p基因表達盒(圖2-C)。

將mt1d表達盒和m1p表達盒的串聯(lián)體連接到pUC19上命名為pUC19-mt1d-m1p，經(jīng)EcoRI和XbaI雙酶切驗證結(jié)果(圖3)顯示，得到了預期為2 659 bp的線性pUC19和2 483 bp的插入片段。pUC19-mt1d-m1p的測序結(jié)果表明，插入片段序列與預期結(jié)果一致。

M-Marker；1-酶切結(jié)果圖3 pUC19-mt1d-m1p的酶切驗證Fig.3 Digestion verification of pUC19-mt1d-m1p

2.2 同源重組載體的構(gòu)建

通過PCR驗證腸膜明串珠菌突變菌株的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖4，由圖4可知，2種突變菌株符合預期，即野生型腸膜明串珠菌菌株擴增的片段大小為1 125 bp、Δaldh::amy菌株擴增的片段大小為3 079 bp、Δaldh::(mt1d-m1p)菌株擴增的片段大小為3 417 bp， 說明在腸膜明串珠菌中成功構(gòu)建了葡萄糖到甘露醇的體系。

1-野生型菌株(1 125 bp)；2-Δaldh::amy(3 079 bp)；3-Marker；4-Δaldh::(mt1d-m1p) (3417 bp)圖4 PCR驗證突變菌株的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis map of mutant strain’s PCR verification

2.3 甘露醇的產(chǎn)量比較

腸膜明串珠菌不同菌株發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的產(chǎn)量見圖5。

1-20 g/L葡萄糖為底物的Δaldh::(mt1d-m1p)；2-20 g/L蔗糖為底物的Δaldh::(mt1d-m1p)；3-20 g/L蔗糖為底物的野生型菌株；4-90 g/L蔗糖為底物的野生型菌株；5-90 g/L蔗糖為底物的Δaldh::(mt1d-m1p)；6-90 g/L蔗糖為底物的Δaldh::(mt1d-m1p)Δdts::amy；7-90 g/L蔗糖為底物的Δaldh::(mt1d-m1p)Δdts::(mt1d-m1p)；8-90 g/L蔗糖為底物的Δdts1ΔD-ldhΔpat::mdhΔstpk::mdh Δfk::mdhΔaldh::(mt1d-m1p)圖5 野生型和突變型菌株的甘露醇產(chǎn)量Fig.5 Mannitol yield of wild-type and mutant-type strains

從圖5可以看出，(1) 以20 g/L葡萄糖為底物時，Δaldh::(mt1d-m1p)的甘露醇產(chǎn)量為2.52 g/L，異型乳酸發(fā)酵細菌-明串珠菌中已經(jīng)構(gòu)建成功了同型乳酸發(fā)酵細菌產(chǎn)甘露醇的代謝途徑；(2) 以20 g/L蔗糖為底物時，Δaldh::(mt1d-m1p)(9.69 g/L)的底物到甘露醇的轉(zhuǎn)化率比野生型(7.27 g/L)提高了33.29%；(3) 以90 g/L蔗糖為底物時，定點插入mt1d-m1p表達盒的菌株轉(zhuǎn)化率比野生型提高了很多，多基因敲除菌株[Δdts1ΔD-ldhΔpat::mdhΔstpk::mdhΔfk::mdhΔaldh::(mt1d-m1p)]產(chǎn)量最高；(4) 以 90 g/L蔗糖為底物時，雙拷貝插入mt1d-m1p表達盒的菌株[Δaldh::(mt1d-m1p)Δdts::(mt1d-m1p)]比單拷貝插入菌株[Δaldh::(mt1d-m1p)、Δaldh::(mt1d-m1p)Δdts::amy]產(chǎn)量高，Δaldh::(mt1d-m1p)Δdts::amy比Δaldh::(mt1d-m1p)產(chǎn)量高，這是dts基因(葡聚糖蔗糖酶)失活造成的。

3 討論

近年來，本課題組一直從事著產(chǎn)甘露醇明串珠菌的遺傳育種工作。為了降低生產(chǎn)成本，以蔗糖代替葡萄糖、果糖作為底物進行了發(fā)酵產(chǎn)甘露醇的研究[18]。以蔗糖作為底物時，既可以在腸膜明串珠菌胞外由葡聚糖蔗糖酶催化生成葡聚糖和果糖，又可以進入胞內(nèi)進行代謝[10]。為了使更多的蔗糖進入胞內(nèi)進行代謝，刪除了單拷貝的葡聚糖蔗糖酶基因(dts)，從而提高了甘露醇的產(chǎn)量[15, 19]。由甘露醇脫氫酶催化果糖轉(zhuǎn)化為甘露醇時，需要NAD(P)H[10]。因此，刪除dts(Δdts)的基礎(chǔ)上，進一步刪除了代謝過程中消耗NAD(P)H的D-乳酸脫氫酶(D-ldh)和乙醛脫氫酶(aldh)編碼基因，進而又提高了甘露醇的產(chǎn)量[20]。腸膜明串珠菌中存在多拷貝的葡聚糖蔗糖酶基因[13]，故刪除了誘導表達葡聚糖蔗糖酶基因的雙組分系統(tǒng)成員-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[21]編碼基因(stpk)[10-11]。腸膜明串珠菌中除了存在乙醛脫氫酶基因外，還有乙醛脫氫酶-乙醇脫氫酶雙功能酶編碼基因[13]，故阻斷了PPK代謝途徑中乙酰磷酸到乙酰CoA 的反應(催化此反應的酶編碼基因為pat)[10-11]。使果糖激酶基因(fk)失活，以便幾乎所有的果糖轉(zhuǎn)化為甘露醇[10-11]。將3個拷貝的甘露醇脫氫酶基因(mdh)敲入到腸膜明串珠菌染色體中，以便提高甘露醇脫氫酶的酶活，進而提高產(chǎn)量[10-11]。最終，構(gòu)建了高產(chǎn)甘露醇的菌株腸膜明串珠菌Δdts1ΔD-ldhΔpat::mdhΔstpk::mdhΔfk::mdh。為了進一步提高蔗糖到甘露醇的轉(zhuǎn)化率，本研究在Δdts1ΔD-ldhΔpat::mdhΔstpk::mdhΔfk::mdh(甘露醇產(chǎn)量為41.0 g/L)基礎(chǔ)上，在染色體的aldh位點上定點插入了mt1d-m1p表達盒串聯(lián)體，從而獲得了突變菌株Δdts1ΔD-ldhΔpat::mdhΔstpk::mdhΔfk::mdhΔaldh::(mt1d-m1p)(47.26 g/L)，轉(zhuǎn)化率又提高了7%。在前期工作中發(fā)現(xiàn)，蔗糖底物為90 g/L時甘露醇產(chǎn)量最高[22]，故本研究采用了90 g/L的蔗糖底物。印度的RESHAMWALA等[12]以質(zhì)粒形式在大腸桿菌過表達了mt1d、m1p和pxtD，因此進行發(fā)酵時必須加入抗生素而保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。本研究是在染色體上定點插入(mt1d-m1p)的，發(fā)酵時不需要加入抗生素。

開始啟動本研究時，企圖通過重疊延伸PCR將mt1d表達盒和m1p表達盒串聯(lián)在一起，但是所有的努力都以失敗而告終。這是2個表達盒所采用的相同的D-ldh基因表達元件在重疊延伸過程中相互干擾而造成的。通過PCR擴增第一個基因表達盒片段時，在引物中引入酶切位點識別序列，將第二個基因表達盒片段插入到這一位點，從而將2個表達盒串聯(lián)在一起了。

本研究通過構(gòu)建葡萄糖到甘露醇的轉(zhuǎn)化體系，使出發(fā)菌株大幅度提高了甘露醇產(chǎn)量，但是改造的菌種還沒有達到生產(chǎn)中能夠采用的水平。微生物發(fā)酵生產(chǎn)甘露醇的方法，能否實際應用的瓶頸是生產(chǎn)成本，故從底物和菌株的遺傳育種角度還需要深入研究。例如，以甘蔗汁作為培養(yǎng)基[22]或以菊粉[23-25]作為底物，都可以降低發(fā)酵成本。

4 結(jié)論

以90g/L蔗糖為底物時，mt1d-m1p表達盒串聯(lián)體的定點插入使初始菌株的蔗糖到甘露醇的轉(zhuǎn)化率提高很多。多基因敲除菌株中定點插入mt1d-m1p表達盒串聯(lián)體又提高產(chǎn)量。雙拷貝插入mt1d-m1p表達盒的菌株比單拷貝插入菌株提高產(chǎn)量。總之，增加甘露醇的合成途徑是增產(chǎn)的手段之一。