馬艷弘，金秋瓊，崔晉，曹培杰，田麗敏，黃開紅

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.蘇州西山國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園區(qū)有限責(zé)任公司，江蘇 蘇州 215111)

無花果(FicuscaricaL.)隸屬?？茻o花果屬，其果汁香氣濃郁、酸甜適口[1]，既含有豐富的維生素、礦質(zhì)元素、氨基酸等，還含有多酚、黃酮、活性多糖、超氧化物歧化酶(SOD)、呋喃香豆素內(nèi)酯等生物活性物質(zhì)[2，3]，具有免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)心血管、降血脂、抗衰老等多重藥理保健功效[4～6]，具有廣闊的市場(chǎng)發(fā)展前景。

由于無花果不耐儲(chǔ)運(yùn)，每年都有大量果實(shí)在盛果期爛在田頭、攤位，給果農(nóng)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了其產(chǎn)業(yè)發(fā)展。在無花果加工領(lǐng)域，果酒加工技術(shù)途徑低碳高效、幾乎可保留其所有的營(yíng)養(yǎng)成分，是最有發(fā)展前景的加工技術(shù)途徑。鄧星星等通過ITS序列分析，鑒定出菌株SUYX-03屬于酵母屬中的釀酒酵母，由發(fā)酵試驗(yàn)得出該酵母菌是適合無花果果酒制作的優(yōu)良的釀酒酵母[7]；蔣成等通過主成分分析研究不同酵母與有機(jī)酸之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)與菌株KD密切相關(guān)的有機(jī)酸種類最多[8]；JustynaPotka-Wasylka等通過選擇參數(shù)包括pH值、酒精含量和發(fā)酵溫度的應(yīng)用程序?qū)o花果酒的發(fā)酵程序進(jìn)行了最優(yōu)化分析與評(píng)估[9]。迄今為止，多數(shù)有關(guān)無花果酒的研究仍主要集中在簡(jiǎn)單加工方面，相關(guān)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝、活性因子檢測(cè)及抗氧化活性等方面仍亟需進(jìn)一步深入研究。本研究通過酵母菌發(fā)酵制備無花果酒，并通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化無花果酒的最佳發(fā)酵工藝并考察維生素C、多酚、黃酮等主要的功能因子及其體外抗氧化活性，旨在為無花果酒的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

布萊瑞克無花果：由蘇州西山國(guó)家農(nóng)業(yè)示范有限責(zé)任公司提供，品種為“瑪斯義陶芬”，八成熟。

釀酒酵母：酵母菌RV171、RV002、BV181、PHYT，安琪酵母股份有限公司。

纖維素酶(活力≥10 000 U·mg-1)、果膠酶(活力≥30 000 U·g-1)：合肥Biosharp生物科技有限公司；福林酚：上海源葉生物科技有限公司；DPPH：南京藤春生物科技發(fā)展有限公司；維生素C檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平(PL303型)：梅特勒-托利多(上海)有限公司；打漿機(jī)(MJ-BL15U11型)：廣東美的生活電器制造有限公司；電熱恒溫水浴鍋(DK-8D型)：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；紫外可見分光光度計(jì)(D-8型)：上海奧析科學(xué)儀器有限公司；漩渦混合儀(XW-80 A型)：海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 無花果酒制備工藝

無花果清洗干凈后用打漿機(jī)破碎榨汁，加入1.56%的纖維素酶和0.28%的果膠酶，于53 ℃條件下酶解90 min，酶解結(jié)束后將果漿糖度調(diào)節(jié)至20%，再添加SO2(K2S2O5)混合均勻，然后接種釀酒酵母發(fā)酵劑保溫發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后用板框壓濾機(jī)進(jìn)行渣液分離，清酒經(jīng)澄清處理后依次經(jīng)硅藻土過濾、膜過濾后灌裝，即為成品。

1.3.2 菌種的活化

將釀酒干酵母粉按照1：20(g·mL-1)的質(zhì)量體積比與4%的葡萄糖溶液混合均勻，在35～37 ℃條件下保溫培養(yǎng)20～30 min，即得酵母菌發(fā)酵劑。

1.3.3 酵母菌的選擇

無花果經(jīng)打漿酶解后，添加80 mg·kg-1SO2，再按照0.04%的接種量分別接種活化的酵母菌RV171、RV002、BV181、PHYT，在25 ℃條件下發(fā)酵10 d，經(jīng)渣液分離、澄清處理后檢測(cè)無花果酒的酒精度和維生素C含量，根據(jù)結(jié)果確定適宜的發(fā)酵菌種。

1.3.4 無花果酒發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)

在確定適宜發(fā)酵菌種的基礎(chǔ)上，分別考察酵母接種量(0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%)，SO2添加量(25、45、65、85、105、125 mg·kg-1)，發(fā)酵溫度(24、26、28、30、32、34 ℃)，發(fā)酵時(shí)間(0、2、4、6、8、10`、12 d)對(duì)無花果酒酒精度的影響，根據(jù)結(jié)果確定適宜的發(fā)酵條件。

1.3.5 無花果酒發(fā)酵工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以SO2添加量、釀酒酵母接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間為試驗(yàn)因素，以酒精度為響應(yīng)值，采用Box-benhnken中心組合設(shè)計(jì)，根據(jù)Design-Expert 8.05軟件優(yōu)化最佳發(fā)酵工藝條件。

1.3.6 無花果酒體外抗氧化活性檢測(cè)

分別取1 mL 無花果酒液，參考馬艷弘等[10]的方法加入不同反應(yīng)劑，根據(jù)517 nm處吸光度計(jì)算DPPH自由基清除率；按照徐靜珠等[11]的方法加入不同反應(yīng)劑，根據(jù)其550 nm處的吸光值計(jì)算羥自由基清除率。

1.3.7 指標(biāo)檢測(cè)

酒精度參照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定；總多酚含量采用福林-酚法測(cè)定[9]，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.010 9x+0.002 1(R2=0.999 1)；總黃酮采用蘆丁-AlNO3法測(cè)定[12，13]，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=9.74x-0.005 3(R2=0.999 4)：維生素C按照南京建成生物工程研究所維生素C測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS18.0和Design-Expert 8.05數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母菌種的確定

考察不同釀酒酵母對(duì)無花果酒的酒精度和維生素C含量的影響，從圖1可以得出，采用釀酒酵母RV171發(fā)酵的無花果酒中酒精度最高，達(dá)12.8% vol；維生素C含量也最高，達(dá)173.52 mg·L-1，其次為酵母菌PHYT，酒精度和維生素C含量分別11.5% vol和173.24 mg·L-1，釀酒酵母RV818發(fā)酵的無花果酒其酒精度和維生素C含量均最低。因此確定酵母菌RV171為最適宜的發(fā)酵菌種。

圖1 不同酵母菌對(duì)無花果酒酒酒精度和維生素C含量的影響Fig.1 Effect of yeast type on alcohol and VC contents of fig wine

2.2 發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 釀酒酵母接種量對(duì)無花果酒酒精度的影響

如圖2可知，隨著干酵母菌接種量的提高，酒精度升高，到接種量為0.03%～0.04%時(shí)，無花果酒的酒精度達(dá)到最高(11.4%vol)；接種量大于0.04%，則酒精度又略有下降。這是由于若接種量小，果汁中的糖不能完全被酵母利用轉(zhuǎn)化，致使酒精度較低；若接種量過大，酵母菌大量生長(zhǎng)消耗了果汁中的糖分，致使產(chǎn)酒精的底物濃度降低從而導(dǎo)致了酒精度的減小。由此確定干酵母菌的適宜接種量為0.03%。

圖2 酵母菌接種量對(duì)無花果酒酒精度的影響Fig.2 Effect of yeast inoculum amount on alcohol content of fig wine

2.2.2 SO2添加量對(duì)無花果酒酒精度的影響

由圖3可知，隨著SO2添加量的增加，無花果酒的酒精度呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)SO2添加量為85 mg·kg-1時(shí)，酒精度達(dá)最大。這是由于SO2添加量低時(shí)會(huì)造成雜菌污染，消耗部分糖份從而造成酒精度的偏低，SO2添加量過高，則又會(huì)抑制酵母菌的生長(zhǎng)從而導(dǎo)致發(fā)酵力下降、酒精度降低。綜合考慮，確定SO2的最適添加量為85 mg·kg-1。

圖3 SO2添加量對(duì)無花果酒酒精度的影響Fig.3 Effect of SO2 concentration on alcohol content of fig wine

2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)無花果酒酒精度的影響

由圖4可知，在所設(shè)溫度范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵溫度的提高，無花果酒的酒精度變化趨勢(shì)是先升高后降低，當(dāng)發(fā)酵溫度為28 ℃時(shí)，酒精度最高；這是由于溫度影響到酵母菌的生長(zhǎng)，溫度低時(shí)，酵母菌發(fā)酵速度慢，產(chǎn)酒精度能力低，但溫度過高，酵母菌衰老速度加快，最終導(dǎo)致了產(chǎn)酒精能力降低。由此確定28 ℃為適宜的發(fā)酵溫度。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)無花果酒酒精度的影響Fig.4 Effects of fermentation temperature on alcohol content of fig wine

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)無花果酒酒精度的影響

圖5可知，在所設(shè)溫度范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵溫度的提高，無花果酒的酒精度變化趨勢(shì)是先升高最后趨于平緩。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為8 d時(shí)，酒精度達(dá)到最高值；大于8 d，酒精度則趨于平緩。這是由于發(fā)酵8 d后，無花果汁中的糖分幾乎消耗殆盡，因而導(dǎo)致酒精含量的穩(wěn)定。由此確定8 d為適宜的發(fā)酵溫度。

2.3 無花果酒發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理優(yōu)化無花果酒發(fā)酵條件。其試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表1。

由表2還可知：因素A，D，B對(duì)無花果酒精度的影響顯著(P<0.01或P<0.05)，C對(duì)酒精度的影響不顯著(P>0.05)，4個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度大小依次為D>A>B>C；交互項(xiàng)AB，AC，AD以及二次項(xiàng)A2，B2，C2，D2對(duì)酒精度的影響顯著(P<0．01或P<0．05)。說明4個(gè)因素能不同程度的對(duì)響應(yīng)值產(chǎn)生影響，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素選擇科學(xué)合理。

表2 方差分析表Table 2 Analysis of variance for the regression model

續(xù)表2

注：*表示P<0.05,影響顯著；**表示P<0.01,影響極顯著；N表示P>0.05,影響不顯著。
Note:*P<0.05,striking contrast;**P<0.01,Extremely striking contrast

2.3.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

根據(jù)響應(yīng)面曲面的陡度程度分析任意2個(gè)因素取零點(diǎn)水平時(shí)，其他兩個(gè)因素的交互作用對(duì)無花果酒酒精度的影響程度，曲面越陡，表明變量對(duì)酒精度的影響越大[16]。由圖6可見，在3個(gè)交互項(xiàng)中，任何2個(gè)交互因素的響應(yīng)面都存在最高點(diǎn)，釀酒干酵母接種量(A)與SO2添加量(B)、釀酒干酵母接種量(A)與發(fā)酵溫度(C)、釀酒干酵母接種量(A)與發(fā)酵天數(shù)(D)的響應(yīng)面曲面坡度均較陡峭，其交互作用對(duì)無花果酒精度的影響也較為顯著。

2.3.3 發(fā)酵條件最優(yōu)條件及驗(yàn)證試驗(yàn)

通過軟件分析優(yōu)化，得到的最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)：釀酒干酵母接種量0.03 %、焦亞硫酸鉀添加量82.89 mg·kg-1、發(fā)酵溫度28.02 ℃、發(fā)酵天數(shù)8.44 d，此條件下無花果果酒的理論酒精度為12.21 %vol。為了操作方便，修正發(fā)酵參數(shù)為：釀酒干酵母接種量0.03 %，焦亞硫酸鉀添加量85 mg·kg-1，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵天數(shù)8 d，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得出無花果果酒的實(shí)際酒精度為12.20% vol，與理論預(yù)測(cè)值吻合程度很高，說明該試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、可靠，該模型可以較好地預(yù)測(cè)無花果酒發(fā)酵條件與酒精度的關(guān)系。

2.4 無花果酒抗氧化活性分析

在最佳發(fā)酵工藝條件下進(jìn)行試驗(yàn)，檢測(cè)無花果汁發(fā)酵前和發(fā)酵結(jié)束后的酒液中的主要抗氧化活性成分和自由基清除率，結(jié)果如表3所示。由表3可見，與發(fā)酵前相比，·OH清除率無顯著差異(P>0.05)，DPPH自由基清除率顯著提高(P<0.05)。說明酒精發(fā)酵可以顯著提高無花果的生物活性物質(zhì)含量和自由基清除能力，無花果酒比無花果汁具有更強(qiáng)的抗氧化能力和生物保健功能。

圖6 各因素交互作用影響無花果酒酒精度的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot showing the effects of yeast inoculum amount,SO2 concentration,fermentation temperature,and time on alcohol content of fig wine

表3 無花果酒抗氧化活性成分和自由基清除能力檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detectionresults of antioxidant components and free radical scavenging activity in fig wine

注：a表示差異顯著(P<0.05)，A表示差異極顯著(P<0.01)。
Note:a indicates significant difference(P<0.05);A indicates that the difference is extremely significant(P<0.01).

2.5 無花果酒理化指標(biāo)分析

在最佳發(fā)酵工藝條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)無花果汁發(fā)酵前和發(fā)酵結(jié)束后無花果酒中的理化指標(biāo)，結(jié)果見表4。由表4可見，無花果酒中的維生素C、總酚、黃酮含量分別比發(fā)酵前提高了4倍、1.27倍、1.64倍。這表明，相較于無花果汁，無花果酒具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其原因可能在于發(fā)酵過程中產(chǎn)生了這些物質(zhì)。

表4 無花果酒理化指標(biāo)Table 4 Physicochemical indices of fig wine

注：a表示差異顯著(P<0.05)，A表示差異極顯著(P<0.01)。
Note:a indicates significant difference(P<0.05);A indicates that the difference is extremely significant(P<0.01).

3 討論與結(jié)論

影響果酒風(fēng)味與品質(zhì)的因素很多，釀酒用果實(shí)品種、釀酒酵母的種類與發(fā)酵性能、工藝條件均能影響果酒的口感和風(fēng)味[17～19]。國(guó)內(nèi)果酒大多采用葡萄酒釀酒酵母發(fā)酵而成，缺乏典型性和專一性，因而很難在不同類型果酒品質(zhì)提升上有所突破，本研究通過考察不同酵母菌對(duì)無花果酒酒精度和維生素C含量的影響，確定釀酒酵母RV171為適宜的發(fā)酵菌種；通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法，建立了發(fā)酵條件為自變量、酒精度為響應(yīng)值的數(shù)學(xué)模型：Y=12.10+0.27A-0.12B+0.058C+0.40D-0.43AB-0.27AC+0.25AD-0.12BC+0.075BD+0.075CD-0.54A2-0.53B2-0.42C2-0.64D2。優(yōu)化得到了無花果酒的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為：釀酒干酵母接種量0.03 %，SO2添加量85 mg·kg-1，發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵天數(shù)8 d，酒精度為12.2 %vol，與預(yù)測(cè)值吻合程度很高，表明該模型科學(xué)合理，可以對(duì)無花果酒的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)起到很好的指導(dǎo)作用。

多酚、黃酮等化合物是葡萄酒、蘋果酒等果酒中重要的組成成分，參與或決定酒的色澤、香氣、穩(wěn)定性、收斂性等，同時(shí)也是果酒發(fā)揮抗氧化、抗衰老等保健功能的物質(zhì)基礎(chǔ)[20～22]。本研究檢測(cè)了最佳工藝條件下生產(chǎn)的無花果酒中維生素C、總酚、黃酮等主要抗氧化成分，并評(píng)估了其自由基清除能力，結(jié)果表明無花果酒對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)75.32%，對(duì)·OH的清除能力達(dá)342.93 U·mL-1，酒中維生素C、總酚、黃酮含量分別比發(fā)酵前提高了4倍、1.27倍、1.64倍?？梢娋凭l(fā)酵過程能夠顯著提高無花果汁的抗氧化活性，無花果酒具有比無花果汁更強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)保健功能，可以作為一種抗氧化劑和自由基清除劑，具有廣闊的市場(chǎng)開發(fā)前景。