李彩麗，辛 英，魏虎來，陳 靜，王 蓓，李 敏

(1.西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030;2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅省新藥臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030)

自噬是進(jìn)化上高度保守的溶酶體降解途徑，當(dāng)細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏、缺氧、藥物等環(huán)境因素的影響下，細(xì)胞溶酶體對(duì)其內(nèi)部的細(xì)胞器、大分子物質(zhì)等內(nèi)容物進(jìn)行“自我消化”的過程。細(xì)胞自噬所產(chǎn)生的物質(zhì)可以被細(xì)胞重新利用，以維持其生命活動(dòng)[1]。自噬根據(jù)其發(fā)生的過程和降解底物的不同，分為巨自噬、分子伴侶介導(dǎo)的自噬和微自噬3種類型。巨自噬廣泛存在于真核細(xì)胞中，它的產(chǎn)生需要多種自噬相關(guān)基因參與，形成雙層膜結(jié)構(gòu)的吞噬泡，吞噬泡包裹細(xì)胞內(nèi)的可溶性蛋白和細(xì)胞器形成自噬體，繼而與溶酶體融合，將其內(nèi)容物進(jìn)行降解加工[2-3]。分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)是細(xì)胞自噬的一種特殊形式，也是哺乳動(dòng)物所特有的自噬途徑。CMA的發(fā)生需要胞質(zhì)內(nèi)熱休克蛋白Hsc70與底物分子的特異氨基酸序列(如KFERQ-樣模體)識(shí)別結(jié)合，結(jié)合形成的復(fù)合物能被溶酶體相關(guān)膜蛋白(LAMP-2a)所識(shí)別，在溶酶體腔內(nèi)Hsc70的介導(dǎo)下，使底物去折疊并轉(zhuǎn)位至溶酶體內(nèi)進(jìn)行降解[4-5]。Cuervo等[6-7]的研究表明，動(dòng)物禁食3 d后，細(xì)胞內(nèi)CMA活性會(huì)明顯提高，胞質(zhì)內(nèi)含有KFERQ信號(hào)肽序列的蛋白質(zhì)明顯減少。這說明細(xì)胞在饑餓的不同階段所選擇的自噬途徑不同，它們順序被激活后，在功能上相互協(xié)調(diào)補(bǔ)充，共同參與細(xì)胞內(nèi)容物的降解，從而維持細(xì)胞的生命活動(dòng)。然而，這種現(xiàn)象在腫瘤細(xì)胞中是否依然存在，目前尚無相關(guān)報(bào)道。本研究以Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞為研究對(duì)象，旨在觀察體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞在饑餓誘導(dǎo)的不同階段，細(xì)胞巨自噬與CMA活性的變化情況，闡明巨自噬與CMA之間的關(guān)系，從而探索它們各自在腫瘤細(xì)胞應(yīng)對(duì)壓力刺激時(shí)的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 試劑D-Hanks液(索萊寶公司)；蛋白提取及定量試劑盒(碧云天公司)；單丹黃酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)(Sigma公司)；Hsc70一抗，Apitomics公司；LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、β-actin一抗，均購自CST公司; 溶酶體相關(guān)膜蛋白-2a(lysosome-associated membrane protein-2a，Lamp-2a)一抗，購自Abcam公司；紅外熒光標(biāo)記的二抗，購自美國LI-COR公司。

1.3 儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本三洋公司)；熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)。

1.4 方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理 采用D-Hanks緩沖液代替細(xì)胞培養(yǎng)液，饑餓誘導(dǎo)對(duì)數(shù)生長期的Raji細(xì)胞，分別收集饑餓誘導(dǎo)0、3、6、9、12 h的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.2MDC熒光染色觀察自噬體 在饑餓誘導(dǎo)不同時(shí)間的Raji細(xì)胞中，加入MDC貯存液，使其終濃度達(dá)到0.05 mmol·L-1，37 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌2次，滴片，用激光共聚焦顯微鏡和熒光顯微鏡分別觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成。

1.4.3Western blot法檢測(cè)Beclin-1、LC3-Ⅰ/Ⅱ、Hsc70和Lamp-2a蛋白的表達(dá) 分別收集對(duì)照組以及饑餓誘導(dǎo)不同時(shí)間的Raji細(xì)胞，PBS洗滌，RIPA裂解液抽提細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒定量測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，加入5×上樣緩沖液并混勻，每個(gè)樣品取50 μg蛋白質(zhì)上樣，SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗室溫孵育1～2 h，洗滌后，加入二抗室溫孵育2 h，洗滌，用Odyssey紅外熒光掃描儀掃描并分析結(jié)果，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析處理，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 饑餓誘導(dǎo)不同時(shí)間Raji細(xì)胞巨自噬活性的改變采用D-Hanks緩沖液代替培養(yǎng)液饑餓誘導(dǎo)Raji細(xì)胞0～12 h，MDC染色后，分別用激光共聚焦顯微鏡和熒光顯微鏡觀察Raji細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成情況。如Fig 1所示，在饑餓誘導(dǎo)的最初幾小時(shí)，MDC熒光強(qiáng)度逐漸增加，在6 h達(dá)到峰值，隨后逐漸下降到基礎(chǔ)水平。

2.2 饑餓誘導(dǎo)不同時(shí)間巨自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平Western blot檢測(cè)饑餓誘導(dǎo)不同階段，Raji細(xì)胞內(nèi)巨自噬標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)水平。如Fig 2所示，LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)水平在饑餓誘導(dǎo)的最初幾小時(shí)均逐漸升高，6 h時(shí)達(dá)到峰值，隨后又逐漸下降。

2.3 饑餓誘導(dǎo)不同時(shí)間細(xì)胞內(nèi)CMA相關(guān)蛋白的表達(dá)水平Hsc-70和Lamp-2a是參與CMA的兩種重要物質(zhì)，分子伴侶Hsc70能特異性識(shí)別帶有KFERQ序列的底物蛋白，促進(jìn)底物去折疊并與LAMP-2a結(jié)合，繼而進(jìn)入溶酶體腔被降解[8-9]。因此，Hsc70和LAMP-2a是檢測(cè)CMA活性的重要標(biāo)志物。Western blot檢測(cè)饑餓誘導(dǎo)0～12 h細(xì)胞內(nèi)CMA的水平，發(fā)現(xiàn)Hsc-70和Lamp-2a的表達(dá)并未像巨自噬那樣在饑餓誘導(dǎo)的早期(3～6 h)明顯升高，而是在饑餓誘導(dǎo)6 h之后才明顯增高，12 h時(shí)達(dá)到峰值(Fig 3)。

Fig 1 The fluorescence intensity of MDC in Raji cells induced by starvation(×100)

A：Detection results of confocal laser-scanning microscopy；B: The fluorescence intensity of MDC was analysed by fluorescence microscopy.

Fig 2 Macroautophagy-related protein expression in starvation-induced Raji cells

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group(0 h)

3 討論

CMA與巨自噬作為細(xì)胞自噬的兩種不同類型，其在腫瘤治療中的作用越來越受到人們的關(guān)注。盡管它們?cè)诎l(fā)生的先后順序、對(duì)底物的選擇性以及調(diào)控機(jī)制等很多方面不同，然而它們?cè)诰S持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面卻有著緊密的聯(lián)系。有研究發(fā)現(xiàn)，巨自噬與CMA在正常細(xì)胞中存在相互協(xié)調(diào)補(bǔ)充的關(guān)系，即當(dāng)巨自噬活性下降或被抑制時(shí)，CMA就會(huì)被活化，從而補(bǔ)償巨自噬的部分功能[10-13]，這說明它們并非獨(dú)立存在的兩條途徑，而是存在著必然的聯(lián)系。然而，這種現(xiàn)象是否在腫瘤細(xì)胞中依然存在，目前尚無相關(guān)報(bào)道。

本研究通過饑餓誘導(dǎo)Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞，觀察細(xì)胞內(nèi)巨自噬和CMA活性的變化，探究腫瘤細(xì)胞受到壓力刺激時(shí)，巨自噬與CMA之間的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，Raji細(xì)胞在D-Hanks緩沖液中分別培養(yǎng)0、3、6、9、12 h，細(xì)胞巨自噬活性在饑餓初期(3～6 h)迅速增加并達(dá)到峰值，與對(duì)照組(0 h)相比較，胞質(zhì)內(nèi)MDC染色陽性的自噬體數(shù)量，以及LC3-Ⅱ和Beclin-1表達(dá)水平在饑餓6 h時(shí)均達(dá)到高峰，與此相反，CMA相關(guān)分子Hsc70和LAMP-2a的表達(dá)水平在此時(shí)并未見明顯上調(diào)。然而，隨著饑餓時(shí)間的延長，細(xì)胞巨自噬活性逐漸降低，并伴隨出現(xiàn)CMA活性的逐漸增加，當(dāng)饑餓12 h時(shí)，巨自噬活性基本達(dá)到對(duì)照組細(xì)胞水平，而CMA活性此時(shí)卻達(dá)到了峰值。由此證明，巨自噬是細(xì)胞應(yīng)對(duì)饑餓這種壓力刺激時(shí)的一種快速而短暫的反應(yīng)，細(xì)胞首先通過巨自噬降解胞質(zhì)內(nèi)生物大分子，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的循環(huán)再利用，為處于饑餓狀態(tài)的細(xì)胞提供首批氨基酸和能量等，以維持生存的需要。隨之巨自噬水平的降低可有效避免一些重要蛋白質(zhì)的非選擇性和無序性降解，與此同時(shí)，CMA的活化通過選擇性降解一些非必需的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步為細(xì)胞生存提供能源物質(zhì)。

Fig 3 CMA-related protein expression in starvation-induced Raji cells

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group(0 h)

本研究證實(shí)，Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞在接受饑餓刺激時(shí)，巨自噬與CMA之間存在相互協(xié)調(diào)和補(bǔ)充的關(guān)系，它們并非同步而是相繼被激活，巨自噬的發(fā)生先于CMA，高巨自噬水平會(huì)抑制CMA的活化，只有當(dāng)巨自噬水平下降時(shí)，才會(huì)出現(xiàn)CMA活性的增加。這一發(fā)現(xiàn)將有助于更好地理解腫瘤細(xì)胞中不同自噬途徑的特點(diǎn)、相互之間的關(guān)系，以及在應(yīng)對(duì)壓力刺激時(shí)的應(yīng)答機(jī)制。