孫曼娜， 婁季武， 趙穎， 付有晴， 劉彥慧， 李亮

1東莞市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心(廣東東莞 523000)； 2南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室(廣東廣州 510515)

脊髓性肌肉萎縮癥(spinal muscular atrophy, SMA)是一組兒童期僅次于假肥大性肌營養(yǎng)不良，居第2位的常見神經(jīng)肌肉疾病，也是嬰兒期最常見的致死性疾病，居所有致死性常染色體隱形遺傳病的第2位。SMA在新生兒中發(fā)病率為1/6 000～1/10 000， 人群攜帶者頻率約為1/50[1-3]。根據(jù)發(fā)病年齡和進(jìn)程，SMA可以分為4種類型：SMA Ⅰ型，又稱嬰兒型，通常6個(gè)月前發(fā)病，不能獨(dú)坐；SMA Ⅱ型，又稱中間型，通常1歲半前發(fā)病，不能獨(dú)立行走；SMA Ⅲ型，又稱少年型，通常1歲半后發(fā)病，可以行走；SMA Ⅳ型，又稱成年型，通常30歲后發(fā)病，癥狀較輕[4]。SMA的發(fā)病機(jī)制是由于染色體5q11.2～q13.3上的生存運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元基因(survival motor neuron gene,SMN)缺陷引起。人類基因組中有兩個(gè)高度同源的SMN基因，SMN1和SMN2，其中，SMN1是致病基因。約96%的SMA Ⅰ～Ⅲ型患者為SMN1基因外顯子(exon)7和8缺失純合子或exon 7缺失純合子，其中exon 7和8缺失純合子約占90%，exon 7缺失純合子約占10%[5-7]。因此SMN1基因exon7純合缺失的檢測對(duì)SMA患者的基因診斷具有重要意義。目前，已有多種方法用于SMA的診斷，例如，毛細(xì)管電泳法、多重連接依賴探針擴(kuò)增法(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)、變性高效液相色譜法(denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)、限制性片段長度多態(tài)性法(restriction fragment lengthpolymorphism,RFLP)、等位基因特異PCR法(alleles specific amplification, ASA)、高分辨率熔解曲線分析法(high-resolution melting, HRM)等[8-12]，這些方法或者對(duì)儀器有特殊要求，或者需要PCR后操作而增加污染風(fēng)險(xiǎn)，因此，臨床應(yīng)用受到一定限制。本研究擬利用探針熔解曲線方法檢測SMN1exon7和SMN2exon7拷貝數(shù)，建立一種簡單快速的SMN1基因exon7純合缺失檢測方法。

1 資料與方法

1.1 病例樣本

1.1.1 正常人樣本 收集2018年1月在東莞市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心進(jìn)行產(chǎn)前地貧基因篩查的孕婦或其丈夫外周血標(biāo)本，共94例，年齡20～42歲，均無SMA臨床相關(guān)病史。該部分樣本用于檢測體系的初步評(píng)價(jià)。

1.1.2 已知基因型樣本收集 樣本來自于2012年1月至2018年9月期間，在東莞市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心進(jìn)行SMA基因產(chǎn)前或產(chǎn)后檢測病例，共238例。其中外周血液標(biāo)本232例，羊水標(biāo)本5例，絨毛1例。經(jīng)患者知情同意，抽取外周血2 mL，羊水10 mL，絨毛2支用于基因組DNA提取。所有樣本均經(jīng)荷蘭MRC-Holland公司的MLPA試劑盒(P060-B2 SMA)檢測，基因型已知。

1.1.3 儀器與試劑 SLAN-96S熒光定量PCR儀購自上海宏石公司；Phire Hot Start Ⅱ DNA聚合酶及配套PCR緩沖液、dNTPs等PCR試劑及測定DNA濃度用的NanoDrop 2000分光光度計(jì)購自美國Thermo Scientific公司；引物及探針由上海生工(Sangon)生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 血液基因組DNA采用廈門致善公司的Lab-820自動(dòng)核酸提取儀進(jìn)行提取。測定DNA濃度后，標(biāo)本保存在-80℃冰箱備用，其中羊水和絨毛DNA均經(jīng)STR分析排除母體組織污染。

1.2.2 引物和探針設(shè)計(jì) 利用Blast程序比對(duì)SMN1基因exon7和SMN2基因exon7序列，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，利用primer 3軟件設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物SMN-F/SMN-R同時(shí)擴(kuò)增兩者序列，擴(kuò)增區(qū)域包含2個(gè)序列差異位點(diǎn)c.840 (SMN1: C;SMN2: T)和c.835-45(SMN1: G;SMN2: A)。針對(duì)這兩個(gè)差異位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)一個(gè)針對(duì)性的熒光探針用于熔解曲線分析基因分型，兩個(gè)探針分別標(biāo)記有不同熒光物質(zhì)。其中c.840位點(diǎn)探針用于區(qū)分SMN1基因exon7和SMN2基因exon7，c.835-45位點(diǎn)探針用作內(nèi)對(duì)照并驗(yàn)證c.840位點(diǎn)探針結(jié)果。利用在線oligo analyzer工具 (https://sg.idtdna.com/site/account/login?returnurl=%2Fcalc%2Fanalyzer) 評(píng)估堿基錯(cuò)配導(dǎo)致的探針溫度(Tm)值變化。引物和探針信息見表1。

表1 引物和探針信息

1.2.3 熒光PCR擴(kuò)增 參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[13]，建立不對(duì)稱PCR體系并對(duì)體系中的緩沖液、鎂離子、引物、探針、dNTPs等成分的濃度進(jìn)行優(yōu)化。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包含50 ng 模板DNA，5 μL 5×buffer, 0.2 mmol/L dNTPs，10 pmol SMN-F引物，1 pmol SMN-R引物，探針各2.5 pmol，0.4 μL Phire Hot Start Ⅱ DNA聚合酶。PCR擴(kuò)增參數(shù)為：起始變性98℃，3 min、50個(gè)循環(huán)：98℃，10 s；58℃，10 s；72℃，10 s。擴(kuò)增完畢后進(jìn)行熔解曲線分析：95℃，1 min；35℃，5 min；70℃，10 s，升溫速率為0.5℃/步，每步停留20 s，并檢測熒光。

1.2.4 敏感性和重復(fù)性分析 將基因型分別為0∶2、2∶0及2∶2的樣本進(jìn)行10倍梯度稀釋，使反應(yīng)體系中DNA量在0.005～50 ng之間，據(jù)此確定檢測體系的敏感性。選取上述基因型樣本各8例進(jìn)行熔解曲線分析，每天分析1次，重復(fù)3次。計(jì)算每天各種基因型熔解曲線峰值Tm的平均值(Mean)、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)及各種基因型3 d全部數(shù)據(jù)的Mean、SD和CV，作為評(píng)價(jià)重復(fù)性的依據(jù)。

1.2.5 正常人樣本檢測 用上述檢測體系對(duì)94例正常成人樣本進(jìn)行檢測，以初步評(píng)估檢測體系可靠性。

1.2.6 臨床樣本的檢測 將收集到的238例已知基因型樣本進(jìn)行隨機(jī)盲法編號(hào)，用本研究建立的方法檢測，檢測結(jié)果與MLPA結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果

2.1 檢測體系基因分型結(jié)果 該方法得到的熔解曲線可以準(zhǔn)確區(qū)分SMN1exon7和SMN2exon7。在FAM通道(c.840位點(diǎn))，SMN1exon7和SMN2exon7的熔解曲線峰分別為～60℃和～54.5℃，SMN1exon7純合缺失患者則僅存在單一的～54.5℃熔解曲線峰；在ROX通道(c.835-45位點(diǎn))，SMN1exon7和SMN2exon7的熔解曲線峰分別為～52℃和～41.5℃，SMN1exon7純合缺失患者則僅存在單一的～41.5℃熔解曲線峰，見圖1。

A、B、C：分別是SMN1∶SMN2為2∶2、2∶0和0∶2的樣本梯度稀釋檢測結(jié)果，其中實(shí)線表示FAM通道信號(hào)，虛線表示ROX通道信號(hào)，不同顏色表示不同DNA量。D：94例正常成人樣本檢測結(jié)果，藍(lán)色表示FAM通道，桔黃色表示ROX通道，帶×曲線表示SMN1純合缺失對(duì)照樣本，帶▲曲線表示其中3例SMN2純合缺失樣本。E：已知基因型樣本的部分代表性峰型，其中1例為c.840和c.835-45位點(diǎn)結(jié)果不一致樣本：藍(lán)色曲線，ROX通道用×標(biāo)記。F：該樣本測序圖，c.840位點(diǎn)和c.835-45位點(diǎn)均為雜合狀態(tài)，提示存在SMN1；其中黑色方框分別表示探針c.840P和c.835-45P結(jié)合區(qū)域，可以看出c.840P探針結(jié)合區(qū)域內(nèi)存在堿基變異c.835-5T>G

圖1熔解曲線圖形及測序結(jié)果

2.2 靈敏度和重復(fù)性分析結(jié)果 10倍梯度稀釋的0∶2、2;2及2∶0基因型樣本的檢測結(jié)果顯示(圖1-A～C)，DNA量在0.05～50 ng之間時(shí)，本研究建立的反應(yīng)體系可以獲得準(zhǔn)確的熔解曲線峰，當(dāng)DNA量為0.005 ng時(shí)，沒有熔解曲線峰，說明反應(yīng)體系的敏感性至少為0.05 ng DNA。在不同時(shí)間對(duì)上述基因型樣本各8例進(jìn)行檢測，可以看到CV在0.05%～0.17%之間，表現(xiàn)出良好的重復(fù)性，見表2。

2.3 94例正常成人樣本檢測結(jié)果 未檢測出SMN1exon7純合缺失，有3例存在SMN2exon7 純合缺失。

2.4 238例臨床樣本檢測結(jié)果 經(jīng)常規(guī)MLPA法和本研究建立的探針熔解曲線法檢測，232份外周血標(biāo)本中，兩種方法分別檢出SMN1 exon7純合缺失標(biāo)本38份、SMN2 exon7純合缺失標(biāo)本11份，對(duì)比分析兩種方法的診斷符合率為100%；6份胎兒標(biāo)本中，SMN1exon7純合缺失標(biāo)本2份，對(duì)比分析兩種方法的診斷符合率為100%。238例樣本中，除1例由于存在其他變異導(dǎo)致2個(gè)探針結(jié)果不一致外，其余樣本的2個(gè)探針結(jié)果均一致。見表3，部分代表性熔解曲線圖見圖1。

3 討論

SMA的發(fā)病機(jī)制是SMN1基因缺陷引起的脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性。絕大部分病例存在SMN1基因的exon7純合缺失，因此，對(duì)于SMN1基因exon7純合缺失的檢測可以診斷出絕大部分SMA患者。但SMN1基因與SMN2基因高度同源，僅有幾個(gè)核苷酸差異，這給SMA患者的診斷帶來一定困擾。和SMN1基因序列相比，SMN2基因exon7的第6位堿基由C變?yōu)門(c.840 C>T)，這一關(guān)鍵改變導(dǎo)致其～80%的mRNA缺乏exon7，進(jìn)而導(dǎo)致編碼蛋白缺陷[14]。這一關(guān)鍵堿基差異為SMA的基因診斷帶來便利，PCR擴(kuò)增后利用各種方法對(duì)該變異進(jìn)行基因分型是幾乎所有SMA分子診斷方法的基礎(chǔ)。

通道檢測批次0∶2 (n=8)2∶2 (n=8)2∶0 (n=8)SMN1SMN2SMN1SMN2SMN1SMN2FAM1-54.37±0.08 (0.15)59.37±0.08 (0.13)53.91±0.09 (0.17)59.56±0.05 (0.08)-2-54.31±0.07 (0.13)59.95±0.04 (0.07)53.91±0.08 (0.15)59.57±0.03 (0.05)-3-54.23±0.07 (0.13)59.90±0.04 (0.07)53.86±0.06 (0.11)59.49±0.06 (0.10)-總計(jì)-54.30±0.09 (0.17)59.93±0.05 (0.08)53.89±0.08 (0.15)59.54±0.06 (0.10)-ROX1-41.58±0.05 (0.12)51.73±0.04 (0.08)41.44±0.04 (0.06)51.53±0.03 (0.06)-2-41.55±0.06 (0.08)51.74±0.04 (0.08)41.44±0.05 (0.10)51.55±0.05 (0.10)-3-41.49±0.06 (0.10)51.71±0.05 (0.10)41.40±0.06 (0.12)51.51±0.06 (0.12)-總計(jì)-41.55±0.06 (0.08)51.72±0.05 (0.10)41.42±0.05 (0.12)51.53±0.05 (0.10)-

表3 238例經(jīng)MLPA檢測的已知SMA基因型樣本檢測結(jié)果

注：-表示在該溫度下沒有熔解曲線峰，+表示在該溫度下有熔解曲線峰。*其中1例為雙峰，基因型實(shí)為1∶2，由于SMN1:c.835-5T>G變異，導(dǎo)致MLPA結(jié)果和c.840P分型錯(cuò)誤，但c.835-45P分型結(jié)果無誤

在本研究中，我們利用熒光PCR結(jié)合探針熔解曲線分析技術(shù)對(duì)c.840C>T變異進(jìn)行基因分型，建立一種簡單快速準(zhǔn)確的SMA分子診斷方法。靈敏度試驗(yàn)顯示至少0.05 ng的基因組DNA即可成功檢測，幾乎所有臨床樣本均可滿足此水平。除了高度的檢測靈敏性，相同基因型樣本在不同時(shí)間進(jìn)行重復(fù)檢測得到熔解曲線圖形相似，Tm值變異度較小，顯示出檢測體系良好的重復(fù)性。而臨床樣本的檢測結(jié)果進(jìn)一步顯示了檢測體系的高度準(zhǔn)確性和可靠性：對(duì)94例正常成人(無SMA相關(guān)病史)樣本進(jìn)行檢測，沒有檢測出SMN1基因exon7純合缺失，與預(yù)期相符；238例已知基因型的臨床樣本的盲法分析除1例不一致以外，其余診斷結(jié)果均與MLPA方法完全符合，顯示了高度的準(zhǔn)確性。

相較于一些需要開蓋操作的檢測方法，如PCR-RFLP、SSCP、MLPA、DHPLC及直接測序等[10, 15-18]，熒光定量PCR的最大優(yōu)點(diǎn)是不需要開蓋操作，可以減少各種污染機(jī)會(huì)，而且自動(dòng)化程度高，可以減少實(shí)驗(yàn)操作，適合大批樣本檢測，如新生兒中SMA篩查。與利用等位基因特異性引物或競爭性引物擴(kuò)增的real-time PCR方法相比[19]，本研究建立的方法只需要一對(duì)引物，檢測體系相對(duì)比較簡單而穩(wěn)定。有研究利用HRM方法對(duì)c.840 C>T進(jìn)行分型[20-21]，該方法具有很高的敏感性和特異性，但HRM對(duì)儀器要求較高，且需要特殊的分析軟件，難以在一般實(shí)驗(yàn)室使用，而我們的方法只需要普通的熒光PCR儀即可。近年有基于高通量測序診斷SMA的報(bào)道[22]，雖然能檢測各種缺失及點(diǎn)突變，但高通量測序無論是對(duì)人員還是設(shè)備等均要求較高，而且成本較高，不適合常規(guī)采用。

在本研究的方法中，對(duì)于結(jié)果的判斷依據(jù)是c.840位點(diǎn)的分型結(jié)果，但我們額外設(shè)計(jì)了一條探針(c.835-45P)用于檢測c.840位點(diǎn)上游50個(gè)核苷酸位置的一個(gè)差異位點(diǎn)(c.835-45G>A)，作為內(nèi)對(duì)照探針并驗(yàn)證c.840位點(diǎn)結(jié)果，以增加檢測可靠性。雖然不排除有些SMA患者的所有SMN1基因的c.840位點(diǎn)堿基突變而變?yōu)镾MN2情況(反之亦可)存在或缺失范圍僅累計(jì)其中一個(gè)探針結(jié)合區(qū)域——這可以導(dǎo)致兩個(gè)探針結(jié)果不一致，但此類SMA患者在所有患者中比例很少。而探針結(jié)合區(qū)域內(nèi)其他核苷酸變異(非檢測位點(diǎn)變異)可能會(huì)影響探針雜交，導(dǎo)致熔解曲線分型錯(cuò)誤。在本研究檢測的所有樣本中，有1例樣本的兩個(gè)探針檢測結(jié)果不一致：c.840位點(diǎn)為單峰，提示SMN1exon7純合缺失，并與MLPA結(jié)果一致(提示基因型為0∶2)，但c.835-45位點(diǎn)為雙峰，不支持前者結(jié)果；直接DNA測序顯示c.840位點(diǎn)和c.835-45位點(diǎn)均為雜合狀態(tài)，并不存在SMN1exon7純合缺失，但在SMN1基因c.835-5位點(diǎn)存在堿基變異T>G (圖1-F)——位于c.840P探針和MLPA探針的結(jié)合區(qū)域內(nèi)，該變異的存在影響了探針和模板的雜交，進(jìn)而導(dǎo)致c.840P分型和MLPA結(jié)果錯(cuò)誤。由此可見，本研究的雙探針設(shè)計(jì)可以有效降低此種風(fēng)險(xiǎn)，提高檢測結(jié)果的可靠性。

另外，雖然不同基因型樣本的熔解曲線峰型有區(qū)別，但其中SMN1和SMN2相對(duì)比值相同的樣本(如比例為1∶1和2∶2的樣本)形成的峰型類似。因此，該方法難以檢測SMN1基因exon7雜合缺失，但缺失與點(diǎn)突變的復(fù)合雜合子在所有患者中比例很少，僅占3%左右。綜上所述，本方法可以檢測出絕大部分SMA患者，而且易于操作，非常適合于大批量樣本檢測。在SMA產(chǎn)前診斷中，為保證結(jié)果的可靠性，通常需要兩種不同原理方法平行檢測，本研究建立的方法簡單可靠，可以作為常規(guī)方法的補(bǔ)充檢測方法。