李長進(jìn)，王永波*，張洪芬，秦世會，陳 燮

(1.貴州大學(xué) 林學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴陽新天學(xué)校，貴州 貴陽 550018；3.畢節(jié)清池鎮(zhèn)普安學(xué)校，貴州 畢節(jié) 551700)

野生中國櫻桃(Prunuspseudocerasus)在我國華北、華中、華南和西南均有一定的分布[1]，其作為寶貴的物種資源基因庫，對櫻桃新品種改良和進(jìn)化，促進(jìn)植物資源的培育、開發(fā)與利用具有重要的價(jià)值[2]。貴州地區(qū)因其特殊的地形、氣候和人文環(huán)境條件，現(xiàn)存野生櫻桃種質(zhì)資源豐富，且不同區(qū)域環(huán)境下品種類型多樣，不少資源果實(shí)性狀優(yōu)良[3-4]。受人類活動影響較小的畢節(jié)山區(qū)分布有自然生長的野生櫻桃植株，樹高25 m，胸徑18 cm，植株適應(yīng)性、抗逆性和豐產(chǎn)性表現(xiàn)均較好。

可溶性蛋白含量的測定是果實(shí)品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值重要評定指標(biāo)[5]，Bradford法是植物組織可溶性蛋白定量測定的常用方法，具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)和干擾少等優(yōu)點(diǎn)[6-11]。種子作為植物的主要繁殖器官其顏色、大小和形狀等特征具有遺傳穩(wěn)定性。種子形態(tài)特征對于植物分類和種子質(zhì)量管理具有重要意義[12-14]。鑒于此，采用Bradford法測定貴州省畢節(jié)市的野生櫻桃果實(shí)可溶性蛋白含量，并對其種子形態(tài)進(jìn)行初步分析，以期為貴州野生櫻桃的資源保護(hù)與選育利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生櫻桃采自貴州省畢節(jié)市，105.878 4°E、27.634 3°N，海拔1 072 m，采摘新鮮野生櫻桃果實(shí)后，立即裝入冷藏箱后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，采用液氮處理后放置于-80℃超低溫冰箱中進(jìn)行貯藏。

測定試劑主要有牛血清白蛋白(Solarbio)和考馬斯亮藍(lán)G-250(Solarbio)。

主要儀器與設(shè)備：UV-9000S紫外分光光度計(jì)；WinSEEDLE種子和針葉圖像分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 果實(shí)可溶性蛋白含量的測定

1)考馬斯亮藍(lán)G-250(CBB)溶液的制備。精確稱取100 mg CBB倒入裝有50 mL 95%乙醇燒杯中，用玻璃棒充分?jǐn)嚢瑁?2 000 r/min離心15 min去除沉淀，加入85%磷酸溶液100 mL，并用蒸餾水將溶液定溶至1 000 mL后，倒入棕色瓶中避光保存。

2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的制備。精確稱取25 mg牛血清白蛋白，采用蒸餾水對牛血清白蛋白進(jìn)行溶解后，逐漸加入蒸餾水把溶液定溶至100 mL，用移液管吸取溶液40 mL，蒸餾水稀釋定溶至100 mL，即得100 μg/mL牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)溶液，把標(biāo)準(zhǔn)溶液放置于冰箱中冷藏保存。

3)CBB溶液及其與BSA和樣品蛋白反應(yīng)液吸光光譜的掃描。分別吸取0.5 mL的BSA溶液和野生櫻桃果肉粗提液于10 mL具塞試管中，加入5 mL的CBB溶液充分混合。以CBB溶液為空白對照，在400～800 nm掃描CBB-BSA復(fù)合物溶液和CBB與野生櫻桃果肉提取液反應(yīng)溶液的吸收光譜，確定溶液的最大吸光度值和最大吸收波長。

4)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將BSA溶液按表1制成1 mL的6個濃度系列，分別加入5 mL的CBB溶液并充分混合均勻，室溫條件放置5 min，在595 nm處測定吸光度值。以BSA溶液濃度值為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的各試劑添加量Table 1 Reagents adding amount for standard curve drawing

5)可溶性蛋白的提取。稱取野生櫻桃果肉0.68 g，加入5 mL磷酸緩沖液作可溶性蛋白浸提液，在冰浴條件下充分研磨后，用磷酸緩沖液沖洗研缽后一并移入至10 mL離心管中，4℃，12 000 r/min離心15 min，取出清液并測定與CBB反應(yīng)液在595 nm處的吸光度，每個樣品3次重復(fù)，計(jì)算可溶性蛋白含量，取其平均值。

6)精密度試驗(yàn)。精確移取1 mL相同濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液6份，分別加入5 mL CBB溶液，充分混勻孵育5 min后測其吸光度，計(jì)算吸光度的RSD。

7)加標(biāo)回收率試驗(yàn)。精確移取1 mL已測定可溶性蛋白含量的樣品蛋白提取液3份，分別準(zhǔn)確加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(BSA)0.2 mL、0.3 mL和0.4 mL，測定混合溶液的蛋白質(zhì)含量，計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.2.2 野生櫻桃種子形態(tài) 選取85個采集的野生櫻桃果實(shí)，稱重后去除果肉，將果核洗凈晾干，用游標(biāo)卡尺分別量取其長軸長度和縱軸長度，與WinSEEDLE(分辨率600 dpi)[15]掃描分析的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 和SPSS 20.0對各項(xiàng)測定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 櫻桃果實(shí)可溶性蛋白的含量

2.1.1 CBB-BSA和CBB-野生櫻桃果肉提取液的吸收光譜圖 由圖1可知，CBB-BSA和CBB-野生櫻桃果肉提取液的最大吸收峰分別處于593 nm和599 nm，與MARION等[6，16]的研究結(jié)果(595 nm)相近，故在測定時可作為吸光度值。CBB-野生櫻桃果肉提取液與CBB-BSA吸收曲線相比，CBB-野生櫻桃果肉提取液溶液的吸收光譜在620 nm和720 nm附近有吸收肩峰位，推測與其可溶性蛋白的組成和結(jié)構(gòu)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白不同有關(guān)，也可能與含有其他可與CBB結(jié)合的大分子有機(jī)物質(zhì)干擾有關(guān)。

注：a為標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液(BSA)+考馬斯亮藍(lán)G-250(CBB)的反應(yīng)液的吸收光譜；b為櫻桃果實(shí)提取液+考馬斯亮藍(lán)G-250(CBB)的反應(yīng)液的吸收光譜。
Note:a,absorption spectra of Coomassie brilliant blue G-250(CBB)dye complexes with Bovine serum albumin(BSA)；b，absorption spectra of CBB dye complexes with wild cherry fruit extract.

圖1標(biāo)準(zhǔn)蛋白和野生櫻桃可溶性蛋白提取液的吸收光譜
Fig.1 Absorption spectrum of BSA and wild cherry soluble protein extract

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程的建立 以BSA溶液中蛋白質(zhì)含量與595 nm處吸光度值的變化繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，得出的線性回歸方程為y=0.005 4x+0.014(R2=0.997 4)。說明蛋白質(zhì)含量(0～100 μg/mL)與吸光度值具有良好的線性關(guān)系，試驗(yàn)條件滿足要求。

2.1.3 可溶性蛋白含量 試驗(yàn)測得野生櫻桃果實(shí)可溶性蛋白含量為83.99 mg/100g FW。

2.1.4 精密度及加標(biāo)回收率 經(jīng)精密度試驗(yàn)，并通過計(jì)算得出吸光度值的RSD為1.68%，系統(tǒng)偏差不顯著，說明試驗(yàn)精密度較好。經(jīng)加標(biāo)回收率試驗(yàn)計(jì)算得加標(biāo)回收率為96%～102%，在95%～105%范圍內(nèi)，RSD為2.46%(小于5%)，試驗(yàn)準(zhǔn)確性符合測定要求，表明該試驗(yàn)方法可用于野生櫻桃果實(shí)可溶性蛋白的快速定量分析。

圖2 野生櫻桃可溶性蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of soluble protein of wild cherry

2.2 種子形態(tài)

由圖3可知，野生櫻桃果實(shí)呈卵圓形(圖3a)，平均長軸長度為(8.03±0.05)mm，平均短軸長度(7.15±0.12)mm，果實(shí)均重0.78 g，果實(shí)可食率為44.5%。果核(內(nèi)果皮)和種子為卵圓形(圖3b和圖3d)，淺黃色。種子被1層堅(jiān)硬致密的木質(zhì)化果核包被，果核縫合線緊密，不易剝離，種胚處于種子頂部(圖3c)。

對WinSEEDLE掃描數(shù)據(jù)與游標(biāo)卡尺測量數(shù)據(jù)分別進(jìn)行檢驗(yàn)得出二者間差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。說明WinSEEDLE掃描的準(zhǔn)確度符合測定要求，故選定該測量值為分析數(shù)據(jù)。野生櫻桃種子的長度為(6.73±0.24)mm，寬度為(5.24±0.19)mm，厚度為(4.38±0.21)mm，縱橫徑比為0.78±0.03，周長為(18.89±0.64)mm。

注：a為野生櫻桃果實(shí)；b為帶殼種子；c為去殼種子；d為櫻桃種子WinSEEDLE投影掃描圖。
Note:a，wild cherry fruit;b,wild cherry seed with shell;c,wild cherry seed without shell;d,WinSEEDLE scanning map of wild cherry seeds.

圖3 野生櫻桃種子的形態(tài)
Fig.3 Wild cherry seed morphology

3 結(jié)論與討論

Bradford法中用95%乙醇來溶解CBB，但高濃度乙醇會對蛋白質(zhì)作用產(chǎn)生影響，為降低干擾，在不影響CBB溶解的前提下，可適當(dāng)降低乙醇的濃度，現(xiàn)通常選用90%乙醇來溶解CBB。野生櫻桃果肉蛋白提取液是一種復(fù)雜成分提取液，其中的酚類物質(zhì)等也會干擾試驗(yàn)結(jié)果[17]。因此，消除試驗(yàn)過程中的干擾可使Bradford法測定蛋白含量更加準(zhǔn)確可靠。試驗(yàn)條件下，蛋白質(zhì)含量與吸光度值具有良好的線性關(guān)系線性回歸方程為y=0.005 4x+0.014(R2=0.997 4)，表明試驗(yàn)條件滿足要求。

野生果樹植物資源經(jīng)過長期的環(huán)境適應(yīng)過程，逐漸形成了獨(dú)特的適應(yīng)性和抗逆性等，是育種和品種改良的寶貴基因庫[18]。植物的果實(shí)和種子具有比較穩(wěn)定的遺傳特征，在植物分類的遺傳上具有重要的參考價(jià)值[19]。果實(shí)和種子的大小可用質(zhì)量、長及寬來體現(xiàn)，其中質(zhì)量是果實(shí)大小的實(shí)際反映，長、寬是果實(shí)外觀大小的直觀表現(xiàn)[20]。試驗(yàn)結(jié)果與陳濤等[21]收集的貴州畢節(jié)地區(qū)幾種櫻桃果實(shí)(S1～S7)測量值相比，果型明顯偏小，果實(shí)可食率約44%。樣品采集于受人類活動影響較小的畢節(jié)市山區(qū)自然分布生長的野生櫻桃植株，樹高25 m，胸徑18 cm，調(diào)查片區(qū)零星分布。實(shí)地觀測植株適應(yīng)性、抗逆性和豐產(chǎn)性表現(xiàn)均優(yōu)。標(biāo)準(zhǔn)偏差變幅最大的是種子長度，其直接決定果形的大小。

采用Bradford法測定野生櫻桃果肉中可溶性蛋白質(zhì)含量，快速靈敏、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，是一種較好的測定方法。野生櫻桃果肉中可溶性蛋白質(zhì)含量為83.99 mg/100g FW，可溶性蛋白含量因不同品種和測量方法而呈現(xiàn)不同的結(jié)果，該野生櫻桃較洪莉等[22]選定的幾種櫻桃果實(shí)可溶性蛋白含量高。果實(shí)和種子為卵圓形，果型較小，果實(shí)長(8.03±0.05)mm、寬(7.15±0.12)mm，均重為0.78 g，可食率為44.5%。種子長(6.73±0.24)mm、寬(5.24±0.19)mm、厚(4.38±0.21)mm、寬長比為0.78±0.03。該野生櫻桃適應(yīng)性強(qiáng)、豐產(chǎn)性好，具有很高的育種利用價(jià)值。