彭宣翔，陳夏曄

(湖南省煙草公司 郴州市公司，湖南 郴州 423000)

木質(zhì)素(lignin)是煙草細(xì)胞壁物質(zhì)的主要成分之一，有益于維持煙草植株直立生長、抗病蟲等。木質(zhì)素是復(fù)雜的苯丙烷單體聚合物，其3種主要組成單體為香豆醇、松柏醇和芥子醇。因單體不同，木質(zhì)素可分為3種類型：S-木質(zhì)素、G-木質(zhì)素和H-木質(zhì)素?？Х人?O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)催化咖啡酸與5-羥基阿魏酸甲基化分別生成阿魏酸與芥子酸，在木質(zhì)素合成中參與S-木質(zhì)素單體的合成[1-2]。在許多植物中，多個COMT基因已經(jīng)被分離和鑒定，并且有多個基因在煙草中進(jìn)行了功能研究[2-5]。如，綠竹COMT基因反向轉(zhuǎn)化煙草后，轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素含量下降28.7%[2]；尾葉桉COMT基因轉(zhuǎn)化煙草成功改變了煙草植株的木質(zhì)素單體組成[4]。但對煙草內(nèi)源COMT基因的研究較為滯后，對煙草工業(yè)的發(fā)展不利。

木質(zhì)素的存在增強(qiáng)了植物體的支撐能力，是植物適應(yīng)陸生的重要標(biāo)志之一。但其給植物細(xì)胞壁的利用帶來了諸多不便，如造紙工業(yè)需用化學(xué)試劑去除木質(zhì)素，增加成本且污染環(huán)境[6-7]。在煙草中，木質(zhì)素含量高，煙葉燃吸時產(chǎn)生較重的木質(zhì)氣，降低了卷煙感官質(zhì)量[8-12]。同時，木質(zhì)素高溫?zé)峤鈺a(chǎn)生較多的有害氣體，危害健康[8，12]。因此，通過基因工程手段調(diào)控?zé)煵菽举|(zhì)素生物合成的研究具有較大的潛在應(yīng)用前景[13-14]。但目前國內(nèi)對煙草內(nèi)源COMT基因的研究尚未見報(bào)道。通過序列同源比對，在普通煙草基因組中鑒定了普通煙草的20個NtCOMT基因，并對其進(jìn)行了序列分析、進(jìn)化樹構(gòu)建、蛋白性質(zhì)分析和表達(dá)譜分析等，旨在為煙草木質(zhì)素生物合成的分子調(diào)控提供參考，進(jìn)而為給煙草工業(yè)提供低害煙葉奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 煙草NtCOMT基因家族鑒定及序列分析

從茄科作物基因組網(wǎng)站(https://solgenomics.net/)下載普通煙草基因組序列，從擬南芥基因組網(wǎng)站(http://www.arabidopsis.org/)下載擬南芥AtCOMT1(AT5G54160)基因序列。以AtCOMT1作為查詢序列，利用BLAST在煙草基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，參數(shù)E值設(shè)為0.001。以得到完整編碼區(qū)的基因序列作為候選NtCOMT基因，并以NtCOMT1、NtCOMT2、NtCOMT3……NtCOMT20依次對煙草NtCOMT基因進(jìn)行命名。

1.2 NtCOMT基因序列分析

依據(jù)序列編號在數(shù)據(jù)庫中下載其相應(yīng)的基因組序列、編碼區(qū)序列和蛋白質(zhì)序列，進(jìn)一步進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)分析和蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測等。利用序列分析在線工具GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制基因結(jié)構(gòu)圖；采用軟件Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測煙草NtCOMT編碼蛋白的理化特性，如分子量和理論等電點(diǎn)等；利用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)和ProtComp 9.0(http://linux1.softberry.com)預(yù)測煙草NtCOMT蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位；利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測煙草NtCOMT蛋白是否含有跨膜結(jié)構(gòu)域。所用軟件均為免費(fèi)在線工具，在進(jìn)行分析時，參數(shù)多采用默認(rèn)值。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

將煙草20個NtCOMT蛋白序列導(dǎo)入MEGA 6.0軟件，利用ClustalW程序?qū)ζ溥M(jìn)行多序列比對；輸出的多序列比對結(jié)果采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap設(shè)為500。

1.4 煙草NtCOMT基因表達(dá)模式分析

從http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/網(wǎng)址下載編號為SRP029184的普通煙草品種K326的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。利用TopHat2軟件提取與煙草NtCOMT基因相匹配的表達(dá)數(shù)據(jù)；相應(yīng)的組織選擇根、幼苗期葉片、團(tuán)棵期葉片、旺長期葉片、打頂后3天葉片和打頂后6 d葉片共6個。最后，利用Cluster 3.0和TreeView對表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析，繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草NtCOMT的蛋白序列

由表1可見，多數(shù)NtCOMT蛋白約含360個氨基酸殘基，分子量在37～41 kDa，大小相當(dāng)，其中NtCOMT14最小，僅含有201個氨基酸殘基，分子量22.59 kDa。NtCOMT蛋白等電點(diǎn)為5.41～7.77，其中，除NtCOMT8、NtCOMT10、NtCOMT11和NtCOMT14為弱堿性外，其余成員為弱酸性，蛋白表面凈電荷為負(fù)電荷。

表1 煙草NtCOMT的蛋白序列Table 1 Sequence of NtCOMT proteins in tobacco

2.2 煙草NtCOMT的基因結(jié)構(gòu)

由圖1可見，NtCOMT基因含有的外顯子數(shù)目為2～5個外顯子，其中50%的基因含有4個外顯子；各個基因內(nèi)含子的數(shù)目和大小均差異較大，如NtCOMT8和NtCOMT17僅1個內(nèi)含子，而NtCOMT10則含4個內(nèi)含子；NtCOMT14基因的第1個內(nèi)含子大小超過3 kbp，而NtCOMT19的第1個內(nèi)含子僅37 bp。此外，基因結(jié)構(gòu)的相似性與其同源性呈正相關(guān)。

圖1 煙草NtCOMT家族成員的基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene structure of the NtCOMT family in tobacco

圖2 煙草與擬南芥NtCOMT基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree for NtCOMT family of tobacco and AtCOMT family of Arabidopsis thaliana

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化性

由圖2可見，NtCOMT1和NtCOMT2與AtCOMT1同源性最高，說明其可能具有相似的功能。相比于擬南芥，煙草含有數(shù)目較大的COMT基因家族，說明其木質(zhì)素合成較擬南芥復(fù)雜。

2.4 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位及保守結(jié)構(gòu)域

亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明(表1)，煙草NtCOMT蛋白約有1/2定位于細(xì)胞質(zhì)，1/2定位于胞外。蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，煙草NtCOMT蛋白結(jié)構(gòu)高度保守，其中Motif1、Motif3、Motif4和Motif5最為保守(圖3)。從圖3還可看出，各成員保守結(jié)構(gòu)域的位置排列相似，其中NtCOMT14在進(jìn)化中丟失了部分結(jié)構(gòu)域，發(fā)生了較大變異，可能已經(jīng)進(jìn)化成為假基因。

圖3 煙草NtCOMT蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.3 Protein domains of the NtCOMT proteins in tobacco

2.5 煙草NtCOMT的基因表達(dá)

由圖4可知，NtCOMT1、NtCOMT2、NtCOMT4、NtCOMT5和NtCOMT19 5個基因在不同生長發(fā)育時期的煙葉中均有較高的表達(dá)量。部分基因只在某個發(fā)育時期高表達(dá)，如，NtCOMT3、NtCOMT11和NtCOMT12僅在團(tuán)棵期葉片中高表達(dá)；NtCOMT13在打頂后葉片中高表達(dá)。其余11個基因在煙葉中表達(dá)量低，說明其在煙草葉片木質(zhì)素的生物合成中不發(fā)揮作用。此外，有10個NtCOMT基因在根中有較高的表達(dá)水平。

圖4 煙草NtCOMT基因在不同時期K326葉片的表達(dá)Fig.4 Expression pattern of NtCOMTs in K326 leaves of different stages in tobacco

3 結(jié)論與討論

煙草木質(zhì)素是煙氣有害成分的主要來源之一。相對于其他植物，對煙草內(nèi)源COMT基因的功能研究較為滯后。本研究在普通煙草K326基因組中鑒定了20個NtCOMT家族基因，并對其基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、蛋白保守結(jié)構(gòu)域和基因表達(dá)情況等進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能。對蛋白家族保守結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，有利于分析保守結(jié)構(gòu)域甚至保守氨基酸殘基在進(jìn)化過程中的重要作用。保守結(jié)構(gòu)分析和進(jìn)化分析表明煙草NtCOMT家族結(jié)構(gòu)較為保守，說明這些保守的序列和高級結(jié)構(gòu)的生物學(xué)功能非常重要。一些結(jié)構(gòu)域丟失的基因可能進(jìn)化成假基因而失去了功能。這有待于進(jìn)一步對基因功能開展研究。研究認(rèn)為，植物細(xì)胞在胞質(zhì)中合成木質(zhì)素單體，然后經(jīng)過囊泡運(yùn)輸?shù)竭_(dá)細(xì)胞壁并進(jìn)一步聚合堆積成木質(zhì)素[15-16]。擬南芥AtCOMT1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)。推測定位于細(xì)胞質(zhì)的NtCOMT蛋白可能參與木質(zhì)素單體的合成，而定位于胞外的NtCOMT蛋白可能參與胞外木質(zhì)素聚合或其他修飾過程。

煙草是收獲和使用煙葉的經(jīng)濟(jì)作物。因此，對NtCOMT家族基因在不同發(fā)育階段的煙葉中進(jìn)行了表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，有9個基因在幼苗期、團(tuán)棵期、旺長期煙葉或打頂后煙葉中具有較高的表達(dá)量。這些葉片高表達(dá)的基因可能參與了煙葉細(xì)胞壁中木質(zhì)素的合成。因此，開展這些基因的功能研究，可為分子水平改良煙葉提供參考。值得注意的是，大部分在煙葉中高表達(dá)的NtCOMT基因在根中也具有較高的表達(dá)量。因此，通過調(diào)控這些基因降低煙葉木質(zhì)素含量存在一定的風(fēng)險，因?yàn)樵诮档腿~片木質(zhì)素含量的同時，可能影響煙草植株的正常生長發(fā)育。解決方案之一是優(yōu)先針對只在葉片中高表達(dá)的基因如NtCOMT11、NtCOMT12和NtCOMT13進(jìn)行功能缺失研究。

木質(zhì)素為煙草生長發(fā)育所必須，但對煙葉品質(zhì)有較大影響。木質(zhì)素含量高，煙葉燃吸時會產(chǎn)生較重的木質(zhì)氣，降低卷煙感官質(zhì)量[8-12]。同時，木質(zhì)素高溫?zé)峤膺€會產(chǎn)生較多的有害氣體，危害消費(fèi)者的身體健康[8,12]。因此，通過基因工程手段降低煙草木質(zhì)素含量具有較大的潛在應(yīng)用前景[13-14,17]。本研究鑒定了普通煙草的20個NtCOMT家族基因，并對其表達(dá)模式進(jìn)行了初步分析，找到了煙草葉片特異高表達(dá)的基因，對煙草木質(zhì)素含量的分子調(diào)控研究具有重要參考價值。