魏子凱，丁紹敏，陸敏興，林海濤，寧晚娥

(1.廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545006；2.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；3.廣西絹麻紡織科學(xué)研究所有限公司，南寧 530031)

蠶絲生物材料是中國(guó)先民最早開發(fā)利用的動(dòng)物蛋白之一。早年間，人們以蠶絲作為紡織纖維原料，制成的絲綢織物、服飾等一直為社會(huì)贊賞，并認(rèn)可為高品質(zhì)紡織品。近年來(lái)，隨著資源的綜合利用與材料潛在價(jià)值的開發(fā)，使得蠶絲成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)[1]。它以極高的蛋白含量、無(wú)毒無(wú)害、較好的生物相容性和良好的生物降解性等特點(diǎn)[2]，成為新型食品[3]、美白美容[4]、醫(yī)藥材料[5-6]、生物材料等[7-8]眾多領(lǐng)域的研究方向，研究者將蠶絲蛋白作為一種多功能新型材料進(jìn)行多用途探索。

蠶絲由兩部分結(jié)構(gòu)組成，分別是外部的絲膠和內(nèi)部的絲素[9]。絲膠是一種球狀蛋白，約占蠶絲總質(zhì)量的20%～30%，其包裹在絲素的外部，對(duì)絲素起到保護(hù)和膠黏作用。它主要由極性側(cè)鏈氨基酸構(gòu)成，有較好的水溶性和吸水性，易發(fā)黃變色[10]。絲素蛋白是一種纖維狀蛋白，氨基酸組成結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，非極性氨基酸占比較大，疏水性相對(duì)較好，力學(xué)性能優(yōu)異[3]，受到了研究者的青睞。通常，蠶絲的溶解方法需要先經(jīng)過(guò)脫膠，再對(duì)絲素蛋白進(jìn)行溶解。常用的溶解方法有CaCl2-乙醇溶解法[11]、溴化鋰/有機(jī)酸溶解法[12-13]和生物酶解法[14]。CaCl2-乙醇溶解速度快，溶解過(guò)程不易控制；有機(jī)酸溶解過(guò)程會(huì)釋放出刺激氣味，對(duì)身體健康有一定的影響；生物酶解法溶解速度極慢，生物酶特異性強(qiáng)，溶解周期太長(zhǎng)，且成本較高。上述方法都將絲素纖維的結(jié)構(gòu)破壞，溶解為多肽，甚至氨基酸。這樣，絲素的結(jié)構(gòu)及其特有性能無(wú)法被利用，使絲素成為親水性的材料，其應(yīng)用受到了一定的限制。

因此，本文將研究一種蠶絲蛋白短纖維的溶解方法，既可以將蠶繭直接溶解成蠶絲蛋白短纖維，使其保持原有的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，又能夠?qū)⒚撃z與絲素溶解共浴完成，減少成本。同時(shí)，整個(gè)工藝過(guò)程安全高效、可控性高，制備的蠶絲短纖維也能夠作為新型載體被研究者利用，開發(fā)其新的用途及價(jià)值。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材 料

桑蠶繭(廣西鹿寨縣貴盛繭絲工貿(mào)有限公司)，NaOH、尿素、對(duì)二甲氨基苯甲醛(AR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，檸檬酸(AR，西隴化工股份有限公司)。

1.2 儀 器

YB71旦尼爾電子天平(常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司)，Y(B)802N八籃恒溫烘箱(溫州大榮紡織儀器有限公司)，KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，SHA-C水浴恒溫振蕩器(鄭州生元儀器有限公司)，SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵(邦西儀器科技有限公司)，LGJ-10D冷凍干燥機(jī)(上海諾頂儀器設(shè)備有限公司)，數(shù)顯PHS-3C酸度計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)，OLYMPUS-BX43生物顯微鏡(北京瑞科中儀科技有限公司)，日立S-570型掃描電子顯微鏡(日本日立公司)，美國(guó)Nicolet5700型紅外光譜儀(美國(guó)熱電尼高力儀器公司)。

2 方 法

2.1 試樣準(zhǔn)備

桑蠶繭清理，取出蠶蛹，用去離子水沖洗3次，清洗表面的灰塵、雜質(zhì)，放入100 ℃的烘箱中干燥1 h。

2.2 溶液配制

由于蠶繭在堿性條件下容易發(fā)黃，蠶絲纖維容易破壞，因此選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%NaOH溶液作為溶劑，按1︰1、1︰2、1︰3、1︰4、1︰5、1︰6、1︰7的溶質(zhì)質(zhì)量比添加尿素到200 mL堿液中充分溶解，配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶解液。

2.3 殘留雜質(zhì)檢測(cè)

先將蠶絲蛋白纖維溶液倒入抽濾裝置進(jìn)行抽濾，再將蠶絲蛋白纖維放入透析袋中進(jìn)一部除雜，每隔2～4 h換一次純水，然后用對(duì)二甲氨基苯甲醛檢測(cè)溶液中的尿素含量[15]，并測(cè)定pH值，直至透析袋中的溶液呈中性、尿素檢測(cè)不到為止。

2.4 蠶絲短纖維的獲取

將透析完畢后的蠶絲纖維再次抽濾，過(guò)濾得到蠶絲短纖維盛放在玻璃皿中，在冷凍干燥機(jī)里進(jìn)行干燥，干燥溫度-45 ℃，干燥時(shí)間10 h。干燥完畢后，稱重記為M2(g)。

2.5 蠶絲短纖維制備效率計(jì)算

蠶繭質(zhì)量M1，干燥后的蠶絲短纖維質(zhì)量M2，制備率計(jì)算公式如下：

(1)

2.6 光學(xué)顯微鏡檢測(cè)

取適量經(jīng)溶解、干燥處理后的蠶絲短纖維放在載玻片上，制備成臨時(shí)裝片，用光學(xué)顯微鏡對(duì)溶解后的蠶絲纖維進(jìn)行觀察，觀察蠶絲纖維的溶解程度，測(cè)定溶解后蠶絲纖維的長(zhǎng)度，并拍照記錄。

2.7 掃描電子顯微鏡檢測(cè)

用日立S-570型掃描電子顯微鏡觀察溶解后的蠶絲短纖維的形貌變化，工作電壓3.0 kV。

2.8 傅立葉紅外光譜(FTIR)分析

取適量脫膠后的蠶絲和實(shí)驗(yàn)制備的蠶絲短纖維，用纖維切片器制成粉末，將樣品與溴化鉀粉末混合后分別制成溴化鉀壓片，在Nicolet5700型紅外光譜儀上進(jìn)行測(cè)試，得到脫膠蠶絲與蠶絲短纖維的紅外吸收光譜圖，分析蠶絲短纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化情況。

3 結(jié)果分析

3.1 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)溶解的影響

圖1為蠶絲纖維溶解時(shí)間隨堿液溶質(zhì)與尿素質(zhì)量之比的變化曲線。由圖1可知，在50 ℃恒溫條件下，隨著堿液與尿素比例逐漸增大，蠶絲纖維溶解時(shí)間曲線呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明尿素質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，蠶絲纖維的溶解速度加快，溶解所需時(shí)間減少。這是由于堿液使得蠶絲蛋白結(jié)構(gòu)中氫鍵斷裂，結(jié)構(gòu)破壞，尿素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，尿素水合物增多，更加有效地阻止蛋白質(zhì)分子間氫鍵的形成，從而加速蠶絲蛋白纖維的溶解速度[16]。因此，溶質(zhì)質(zhì)量比應(yīng)選擇高質(zhì)量分?jǐn)?shù)比。

圖1 溶解時(shí)間隨堿液溶質(zhì)與尿素之比的變化Fig.1 Changes of dissolution time with the ratio of lye to urea

3.2 溫度對(duì)溶解的影響

圖2是3個(gè)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，蠶絲纖維溶解時(shí)間與溫度的關(guān)系曲線。由圖2可以看出，隨著溫度的升高，蠶絲纖維的溶解時(shí)間曲線呈下降趨勢(shì)，且下降趨勢(shì)逐漸變緩。溫度為50 ℃時(shí)，3個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的蠶絲纖維的溶解時(shí)間都大于80 min；當(dāng)溫度提高到70 ℃時(shí)，蠶絲纖維的溶解速度都為20 min左右。這是因?yàn)殡S著溫度的增加，溶液中的分子運(yùn)動(dòng)加快，加快了蠶絲纖維的溶解速度，同時(shí)，增加溫度也為氫鍵的斷裂提供更多的鍵能，使其更容易斷裂。因此，溫度選擇60～65 ℃為宜。

圖2 溶解時(shí)間隨溫度的變化Fig.2 Changes of dissolution time with temperature

3.4 時(shí)間對(duì)溶解的影響

圖3為蠶絲纖維長(zhǎng)度與溶解時(shí)間的關(guān)系。從圖3可以看出，當(dāng)溶解時(shí)間為35 min左右時(shí)，才會(huì)出現(xiàn)蠶絲短纖維的長(zhǎng)度曲線，這是因?yàn)樾Q繭在溶解為短纖維的過(guò)程中主要有3個(gè)形態(tài)，分別為蠶繭、蠶絲、蠶絲短纖維。從蠶繭到蠶絲需要蠶繭在溶液當(dāng)中充分浸泡、軟化，需要時(shí)間為5 min左右；軟化后的蠶繭逐漸膨化、松散為蠶絲也需要20 min以上。蠶絲溶解為蠶絲短纖維也需要一定的時(shí)間，如果時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，蠶絲纖維將溶解得更短，甚至完全溶解；如果時(shí)間過(guò)短，蠶絲纖維長(zhǎng)短不一，均勻度不夠。為使蠶絲纖維更均勻，過(guò)程易于控制，此過(guò)程的時(shí)間也需要10 min以上。因此，整個(gè)溶解過(guò)程的時(shí)間選擇為40～45 min。

圖3 蠶絲纖維長(zhǎng)度隨溶解時(shí)間的變化Fig.3 Changes of silk fiber length with dissolution time

3.4 蠶絲短纖維的光學(xué)顯微鏡觀察

由于溶質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和溫度的增加，蠶絲纖維溶解的時(shí)間減少，但選擇高質(zhì)量分?jǐn)?shù)、高溫度的溶解條件，蠶絲纖維溶解的速度太快，蠶絲完全溶解，同時(shí)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)與溫度又相互制約，導(dǎo)致條件不宜控制。因此，選擇蠶絲短纖維的溶液用顯微鏡觀察其形貌及均勻度，確定最佳的溶解條件。圖4為蠶絲短纖維的顯微鏡示意，圖(a)中，蠶絲短纖維長(zhǎng)短不一，均勻度不高；圖(c)中蠶絲纖維溶解過(guò)度，蠶絲短纖維所剩不多；圖(b)中蠶絲短纖維長(zhǎng)度均勻，數(shù)量眾多。圖4(a)(b)兩圖比較，說(shuō)明60 ℃時(shí)，溶質(zhì)比1︰6的蠶絲短纖維更均勻；通過(guò)圖4(b)(c)兩圖比較，說(shuō)明溶質(zhì)比1︰6時(shí)，60 ℃的蠶絲短纖維更多。綜合考慮，蠶絲短纖維制備的最佳條件為溶質(zhì)質(zhì)量比1︰6,溫度60～65 ℃，溶解時(shí)間40～45 min。

圖4 蠶絲短纖維的光學(xué)顯微鏡示意Fig.4 Optical micrograph figure of silk short fiber

3.5 蠶絲短纖維的電鏡觀察

圖5為蠶絲短纖維的電鏡示意。從圖5(a)可以看出，蠶絲短纖維兩端的的斷口很不平整，部分存在些許毛細(xì)的絲屑，這是溶液在溶解纖維的過(guò)程中，蠶絲中氫鍵分布不均勻，斷裂時(shí)需要的斷裂能量不同，蠶絲纖維受力不平衡，直至纖維被拉斷，形成不平整的斷口。圖5(b)顯示，溶液對(duì)絲素纖維的表面造成了破環(huán)，但蠶絲短纖維表面整體還是平整光滑，只有少許的殘留絲屑，這是由于絲素纖維斷裂過(guò)程中，斷口的碎屑溶于溶液當(dāng)中，在沖洗時(shí)未沖洗掉而形成的殘留物。

圖5 蠶絲短纖維的電鏡示意Fig.5 Electron microscopy (SEM)figure of silk short fiber

3.6 蠶絲短纖維的紅外圖譜

圖6 脫膠蠶絲與蠶絲短纖維的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectroscopy of raw silk and silk short fiber

圖6為脫膠蠶絲與蠶絲短纖維的紅外光譜圖，在1 621 cm-1和1 514 cm-1處有吸收峰，分別歸屬于酰胺Ⅰ帶(β折疊結(jié)構(gòu))和酰胺Ⅱ帶(α螺旋結(jié)構(gòu))，在1 229 cm-1歸屬于蛋白質(zhì)分子肽鍵中的C—N伸縮振動(dòng)(酰氨Ⅲβ折疊結(jié)構(gòu))，669 cm-1為酰氨Ⅳ的吸收峰，1 067 cm-1附近吸收峰歸屬于肽鏈中C—C伸縮振動(dòng)(1 059 cm-1酰胺Ⅴβ折疊結(jié)構(gòu))[17]。在1 445 cm-1處的特征峰可歸屬于C—H鍵的面內(nèi)彎曲振動(dòng)(C—H基團(tuán)的變形振動(dòng))，1 163 cm-1處的特征峰歸屬于C—O反對(duì)稱伸縮振動(dòng)，3 282 cm-1處的吸收峰可歸屬于動(dòng)物纖維中蛋白質(zhì)分子N—H伸縮振動(dòng)，2 980 cm-1處對(duì)應(yīng)的O—H伸縮振動(dòng)帶，在2 920、2 980 cm-1處有吸收峰,歸屬為亞甲基(CH2)的伸縮振動(dòng)，在610、626 cm-1附近都有吸收峰，可歸屬于N—H彎曲振動(dòng)。在975 cm-1和996 cm-1處是桑蠶絲Ala—Gly—Ala結(jié)構(gòu)的特征吸收峰，3 076 cm-1應(yīng)為蛋白質(zhì)分子中酰氨鍵的特征吸收峰，這是蛋白質(zhì)纖維所具有的特征譜線。從圖6可看出，脫膠蠶絲與蠶絲短纖維的紅外光譜圖基本一致，說(shuō)明蠶絲蛋白結(jié)構(gòu)基本沒(méi)有發(fā)生變化，特有的Ala—Gly—Ala結(jié)構(gòu)依然存在。在541 cm-1附近吸收峰可歸屬于C—O面外彎曲振動(dòng)，蠶絲短纖維在此處的吸收峰增多，原因尚不清楚，可能是由于原蠶絲在斷裂過(guò)程中，氫鍵被打開，更多的羧基暴露在溶液中，并受到不同程度的影響，使化學(xué)鍵結(jié)合方式發(fā)生些許改變，從而相對(duì)于原蠶絲的紅外光譜圖發(fā)生小幅度的偏移。

3.7 蠶絲短纖維的制備率

表1為蠶絲短纖維的制備率匯總，可以看出，蠶絲短纖維的制備率為40%～50%。眾所周知，蠶絲中的絲膠含量約為30%，絲素的含量約為70%，從上述電鏡與紅外分析，在制備的過(guò)程中，蠶絲的絲膠基本去除，從數(shù)據(jù)分析，絲素的損失量近30%，也說(shuō)明實(shí)驗(yàn)制備的蠶絲短纖維為絲素蛋白短纖維。

表1 蠶絲短纖維制備率匯總Tab.1 The summary table of preparation rate of silk short fiber

4 結(jié) 論

利用單因素控制法，得到制備蠶絲蛋白短纖維的最佳工藝為：溫度60～65 ℃，溶質(zhì)之比1︰6，溶解時(shí)間約40 min，蠶絲短纖維的制備率40%～50%。得到的蠶絲短纖維絲膠大部分已經(jīng)去除，表面基本平整光滑，蠶絲蛋白纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)基本沒(méi)有破壞，依然是高分子絲素蛋白纖維結(jié)構(gòu)，不具有親水性，可以將其應(yīng)用于食品添加劑、面膜基材、藥物緩釋載體、生物支架材料等方向，使其發(fā)揮更大的實(shí)用價(jià)值。