楊會(huì)，宋珂，李慧，白云綺，王淑琪，吳圣賢，陳立新，聶波*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院/中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700

四妙勇安湯由金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草四味藥組成，最早見(jiàn)于華佗《神醫(yī)秘傳》，后收載于《驗(yàn)方新編》，具有清熱解毒、活血通脈之功[1-4]。課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，四妙勇安湯可以通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，減輕動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[5-7]。根據(jù)四妙勇安湯處方所含化學(xué)成分的理化性質(zhì)，課題組采用不同濃度乙醇提取，大孔吸收樹(shù)脂分離純化，結(jié)合細(xì)胞藥效學(xué)篩選，得到CS03、CS04、CS05 3個(gè)活性部位，通過(guò)體外藥效學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)篩選，確定CS03∶CS04∶CS05=345∶270∶258為最佳活性配比，組成該配伍方，已獲得專(zhuān)利授權(quán)[8]。

中藥成分的定性鑒別與定量測(cè)定是保證其安全、有效、質(zhì)量可控的基礎(chǔ)和前提[9]，是現(xiàn)代化中藥產(chǎn)業(yè)的重點(diǎn)內(nèi)容。目前還沒(méi)有該配伍方定性鑒別和含量測(cè)定的相關(guān)研究，薄層色譜法因能夠同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行分離、樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)高效、簡(jiǎn)便直觀(guān)的優(yōu)勢(shì)在中藥的分析及鑒別中被廣泛應(yīng)用；HPLC由于分離效率高、選擇性好、檢測(cè)靈敏度高、操作自動(dòng)化、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于中成藥質(zhì)量控制[10-11]，為了更好地控制該配伍方的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜建立了該配伍方中玄參、甘草的定性鑒別方法，并采用HPLC技術(shù)，以綠原酸和哈巴俄苷為檢測(cè)指標(biāo)建立了配伍方中金銀花、玄參兩味藥材的的含量測(cè)定方法，為該配伍方的新藥研發(fā)提供簡(jiǎn)單、快速、有效的質(zhì)量控制方法。

1 材料

1.1 儀器

高效液相系統(tǒng)為Agilent1100 HPLC系統(tǒng)，包含DAD檢測(cè)器、二元泵、在線(xiàn)脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器；AEG-40SM型電子天平(日本島津公司)；SSW-420-2S型電熱恒溫水槽(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng))；ZF-20D暗箱式紫外分析儀(上海寶山顧村電光儀器廠(chǎng))；202-2AB型電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；雙槽玻璃層析缸(規(guī)格：10 cm×10 cm)；玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管(華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠(chǎng)，內(nèi)徑為0.5 mm，管長(zhǎng)為100 mm，硬質(zhì)中性玻璃)；顯色噴霧瓶(華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠(chǎng))；硅膠G薄層板(青島海洋化工廠(chǎng)分廠(chǎng)，規(guī)格為10 cm×20 cm，厚度為0.20～0.25 mm)。

1.2 試藥

對(duì)照藥材金銀花、玄參、甘草(中國(guó)食品藥品檢定研究院，供薄層色譜用，批號(hào)分別為：121060-200906、121008-200906、120904-200512)；乙腈為色譜純(德國(guó)Merck公司)；對(duì)照品綠原酸、哈巴俄苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用，批號(hào)分別為110753-200413、111730-200605)；Milli-Q超純水；其他試劑均為分析純(北京化學(xué)試劑廠(chǎng))。

2 方法與結(jié)果

2.1 玄參薄層色譜鑒別

取配伍方4 mg，加甲醇5 mL，振搖，使溶解，作為供試品溶液。另取玄參對(duì)照藥材粉末1 g，加甲醇10 mL，浸泡1 h，超聲處理30 min，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)?5 mL水溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為對(duì)照藥材溶液。哈巴俄苷配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的溶液。制備不含玄參的樣品，按前法同樣操作，作為陰性對(duì)照樣品溶液。鑒別方法參考2015版《中華人民共和國(guó)藥典》[12]。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，樣品兩次重復(fù)點(diǎn)樣，供試品色譜中，與對(duì)照品、對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上，供試品溶液顯相同的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

注：1.玄參對(duì)照藥材；2.哈巴俄苷；3.樣品；4.樣品；5.陰性。圖1 玄參薄層鑒別色譜圖

2.2 甘草薄層鑒別

取甘草酸銨對(duì)照品加甲醇制成質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品溶液。參考2015版《中華人民共和國(guó)藥典》[13]制備甘草對(duì)照藥材溶液、樣品溶液和陰性對(duì)照樣品溶液并進(jìn)行鑒別。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，樣品兩次重復(fù)點(diǎn)樣，供試品色譜中，在與對(duì)照品、對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

注：1.甘草對(duì)照藥材；2.甘草酸銨；3.樣品；4.樣品；5.陰性。圖2 甘草薄層鑒別色譜圖

2.3 綠原酸、哈巴俄苷含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：ZorbaxSB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈，梯度洗脫(0～15 min，5%～10%B；5～15 min，10%～14%B；15～18 min，14%～17%B；18～25 min，17%～81%B；25～40 min，81%～65%B；70～80 min，65%～20%B)；流速：1.0 mL·min-1；DAD檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：365 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

2.3.2 樣品制備 對(duì)照品溶液制備：精密稱(chēng)取綠原酸、哈巴俄苷對(duì)照品，加甲醇制成每mL含綠原酸、哈巴俄苷分別為0.2、0.02 mg的溶液，即得。

供試品溶液制備：取配伍方100 mg，精密稱(chēng)定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，超聲30 min，補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，過(guò)微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 方法學(xué)考察

2.3.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性與專(zhuān)屬性 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.1%甲酸水(32∶68)為流動(dòng)相；柱溫：30 ℃。理論塔板數(shù)按綠原酸、哈巴俄苷峰計(jì)算應(yīng)不低于1000、5000。取供試品溶液連續(xù)進(jìn)6針，進(jìn)樣后HPLC圖，對(duì)照品和供試品中綠原酸、哈巴俄苷的保留時(shí)間一致，見(jiàn)圖3。

2.3.3.2 線(xiàn)性關(guān)系 精密稱(chēng)取干燥的綠原酸、哈巴俄苷對(duì)照品，加甲醇分別制成質(zhì)量濃度為0.195、0.019 2 mg·mL-1的溶液，分別進(jìn)樣1、2、4、6、8 μL和1、2、5、10、20 μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以綠原酸、哈巴俄苷對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)對(duì)數(shù)

注：A.對(duì)照品綠原酸；B.對(duì)照品哈巴俄苷；C.供試品。圖3 四妙勇安湯活性配伍方專(zhuān)屬性考察圖譜

值為橫坐標(biāo)，峰面積對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其回歸方程分別為Y=0.000 8X+0.002 2，r=0.999 9；Y=0.000 4X+0.000 3，r=1.000 0，綠原酸和哈巴俄苷分別在0.195～1.560、0.019 2～0.384 0 μg·μL-1線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.3.3.3 供試品溶液制備 取配伍方40 mg，精密稱(chēng)定，置于10 mL容量瓶中，加50%的乙腈定容，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3.3.4 精密度試驗(yàn) 分別取質(zhì)量濃度為39.0 μg·μL-1的綠原酸對(duì)照品溶液和質(zhì)量濃度為19.2 μg·mL-1的哈巴俄苷對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，峰面積RSD分別為0.2%、0.2%。

2.3.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的配伍方，精密稱(chēng)取40 mg，共6份，依法提取測(cè)定，供試品綠原酸及哈巴俄苷含量RSD分別為0.60%、0.25%。

2.3.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液分別在0、3、6、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，綠原酸峰面積分別為1 233.6、1 231.6、1 235.3、1 225.8、1 240.7、1 233.4，RSD為0.4%，哈巴俄苷峰面積分別為128.5、129.2、129.1、124.4、125.8，RSD=1.5%，結(jié)果表明供試品溶液中綠原酸、哈巴俄苷24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3.7 回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取配伍方20、100 mg(其中綠原酸及哈巴俄苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.3%、0.25%)，各9份，置于10 mL容量瓶中，分別精密加含有綠原酸0.90、1.13、1.37 mg的對(duì)照品溶液，含有哈巴俄苷0.20、0.25、0.30 mg的對(duì)照品溶液，加50%乙腈定容，定容后搖勻，依法提取測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 綠原酸和哈巴俄苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.3.4 配伍方中綠原酸、哈巴俄苷的含量測(cè)定 取配伍方40 mg，精密稱(chēng)定，依法提取制成供試品溶液，進(jìn)樣二次測(cè)定，以外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算，即得，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 配伍方中綠原酸、哈巴俄苷含量測(cè)定

3 討論

3.1 定量藥效成分的確定

已有數(shù)據(jù)表明，四妙勇安湯水煎液主要含有環(huán)烯醚萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、苯丙素類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)等多種成分[14-15]。在該配伍方中，金銀花和玄參為君藥，金銀花主要含有奎寧酸類(lèi)和黃酮類(lèi)成分，玄參中主要成分為環(huán)烯醚萜類(lèi)成分，《中華人民共和國(guó)藥典》2015版規(guī)定，金銀花藥材中主要檢測(cè)綠原酸和木犀草苷兩個(gè)成分；玄參藥材中主要檢測(cè)哈巴苷和哈巴俄苷兩個(gè)成分，因配伍方是采用提取并經(jīng)大孔樹(shù)脂富集獲得洗脫部位，經(jīng)活性篩選配伍而獲得，前期質(zhì)譜鑒定中發(fā)現(xiàn)木犀草苷含量較低，哈巴苷未能檢測(cè)到，不作為該配伍方的含量測(cè)定的指標(biāo)性成分，因此選擇綠原酸和哈巴俄苷作為配伍方的含量測(cè)定成分。文獻(xiàn)報(bào)道，綠原酸和哈巴俄苷均可通過(guò)激活PPAR-γ受體，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)具有較好的抑制作用，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的活性，因此選擇綠原酸和哈巴俄苷作為配伍方的藥效成分進(jìn)行含量測(cè)定[16-18]。

3.2 樣品處理、色譜條件的優(yōu)化

在本實(shí)驗(yàn)中供試品溶液制備方法，參照《中華人民共和國(guó)藥典》金銀花、玄參含量測(cè)定供試品溶液制備方法設(shè)計(jì)，考慮到本品為55%乙醇提取后大孔樹(shù)脂富集得到的配伍方，結(jié)合流動(dòng)相采用的乙腈-甲酸水系統(tǒng)洗脫，所以筆者選擇用50%的乙腈水溶液來(lái)溶解樣品，溶解效果很好。對(duì)本品的含量測(cè)定，筆者采用乙腈和0.1%甲酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，考察了色譜條件，結(jié)果配伍方中綠原酸、哈巴俄苷分離度好，靈敏度高，方法合理可靠。

“鑒別”是鑒定中藥真假的檢測(cè)項(xiàng)目，“含量測(cè)定”是對(duì)中藥材中主要藥效成分或指標(biāo)性成分的定量控制，是保障中藥材有效性的最重要的指標(biāo)，也是評(píng)價(jià)中藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要指標(biāo)。本研究基于藥效導(dǎo)向篩選四妙勇安湯活性部位，根據(jù)體外藥效和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確定療效最佳的配伍方，首次同時(shí)對(duì)該配伍方中玄參和甘草的化學(xué)成分進(jìn)行薄層鑒別，采用HPLC的方法對(duì)配伍方中綠原酸和哈巴俄苷進(jìn)行含量測(cè)定，為其配伍方的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究提供參考。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)所建立的四妙勇安湯活性部位配伍方以哈巴俄苷和甘草酸銨為指標(biāo)的薄層色譜鑒別方法專(zhuān)屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，以綠原酸和哈巴俄苷為指標(biāo)的HPLC含量測(cè)定方法具有較好的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性，操作簡(jiǎn)便，標(biāo)準(zhǔn)可行，為有效控制該配伍方的質(zhì)量提供準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)方法，也為配伍方作為新藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考。