段學偉，于晶，張昭，徐碩，范永芳

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所/中草藥物質基礎與資源利用教育部重點試驗室，北京 100193

黃檗PhellodendronamurenseRupr.為蕓香科黃檗屬落葉喬木，樹皮作為中藥關黃柏使用，具瀉火除蒸、消炎殺菌、清熱燥濕的功效[1]。黃檗為國家二級重點保護野生植物，野生資源匱乏[2]。課題組發(fā)現不同產地黃檗種子特性差異很大，尤其是休眠程度，所需低溫解除休眠天數可相差幾十乃至百天[3]，這種現象的存在對黃檗的人工種植造成諸多的困難。目前對種子休眠的研究大多集中在對種子休眠的解除上，而對黃檗種子休眠的原因很少涉及。本研究通過比較同一觀察點相同植株不同年份種子的性狀，控制其他變量，分析溫度因子對種子性狀的影響，以期為黃檗種子休眠的形成機制研究提供理論依據以及為人工種植提供指導意見。

1 材料

黃檗種子采集于北京藥用植物園，依據在園內的不同位置，分別標記為Y1、Y2、Y3、Y4和Y5，五個觀察點的氣候條件基本相同，樹齡略有不同。固定植株采集種子，每個觀察點不少于兩棵樹，于每年的10月中旬采收黃檗果實。由于每年結果數量不同，Y1和Y2采集了2015、2016和2017連續(xù)三年的果實，Y3和Y4采集到了2015和2016年的果實，Y5采集到了2016和2017年的果實。采集到的果實曬干后，放置于陰涼干燥處保存，實驗前去除果肉，洗凈晾干后得到黃檗種子。樣品經中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所張昭研究員鑒定為黃檗PhellodendronamurenseRupr.的種子，憑證標本保存于藥用植物研究所。

2 方法

2.1 種子長度、厚度及重量的測定

每個處理隨機選取60粒種子，隨機分成3組，每組20粒，游標卡尺測量種子長度及厚度；采用千粒法，3個重復測量種子重量。

2.2 種子休眠程度檢測

2.2.1 種子發(fā)芽率測定 取種子經蒸餾水浸泡24 h后，放入4 ℃冰箱分別低溫層積0、15、30、45、60、75、90、105、120、135 d。從冰箱取出后置于光照培養(yǎng)箱中進行萌發(fā)實驗，萌發(fā)條件為：24 ℃，14 h，光照3000 lx；15 ℃，10 h，無光。每個處理設置5個重復，每個重復50粒種子。

2.2.2 種子休眠程度指標選擇 選取種子發(fā)芽率首次達到50%所需低溫層積天數和經低溫層積后的最高發(fā)芽率作為種子休眠程度的衡量指標。

2.3 溫度數據的獲取

樣點溫度通過HOBO U23-001溫度記錄儀獲取，將溫度記錄儀放置于觀察點附近避光通風處，記錄儀每2 h記錄1次。通過物候觀察，得到黃檗萌芽期為每年的4月3日至11日；花期為每年的4月21日至27日；果期為每年的5月9日至8月26日；生長期為每年的4月3日至10月18日。各物候期的日均溫度總和為各物候期積溫；各物候期的日均溫平均值為各物候期均溫；各物候期日最高溫與日最低溫差值的平均值為各物候期的平均溫差；一年中日平均氣溫大于20 ℃日平均氣溫的總和為大于20 ℃積溫。溫度數據見表1。

表1 2015年至2017年溫度數據 ℃

2.4 數據分析方法

數據統(tǒng)計分析采用SPSS V21.0。差異性分析采用單因素方差分析法；相關性分析采用speraman法。

3 結果

3.1 不同年份種子長度、厚度及重量比較

在本研究中，通過長度表征種子大小、厚度表征子葉厚度。由于只有Y1和Y2連續(xù)三年采集到種子，種子年度間性狀的比較只選取Y1和Y2兩個觀察點數據。測量2015、2016和2017年Y1和Y2的種子長度、厚度和重量，數據見表2。

表2 不同年份黃檗種子性狀比較

注：同一列不同字母表示差異顯著，大小寫字母分別代表P<0.01，P<0.05。

三年間種子性狀具有顯著性差異：Y1和Y2的種子長度均為2016年>2017年>2015年，差異最大為0.32 mm；Y1和Y2的種子厚度均為2017年>2015年>2016年，差異最大為0.19 mm；Y1和Y2種子重量均為2017年>2015年>2016年，差異最大為0.192 9 g。

3.2 不同年份種子休眠程度比較

不同年份種子休眠程度結果見圖1、表3。由圖1可以看出，兩個觀察點不同年份間的種子休眠程度總體趨勢相同，均為在低溫層積0～60 d內，發(fā)芽率排序為2017年>2016年>2015年；在低溫層積120、135 d時，發(fā)芽率排序為2016年>2017年>2015年。

三年間Y1和Y2的休眠程度均具有顯著性差異(表3)。在觀察點Y1中，2015年種子休眠程度最深，三年間發(fā)芽率達到50%所需低溫天數最大差異可達61 d，最高發(fā)芽率差異可達25%；觀察點Y2與Y1結果相似，2015年種子休眠程度最深，三年間發(fā)芽率達到50%所需低溫天數最大差異可達60 d，最高發(fā)芽率差異可達30%。

圖1 不同年份黃檗種子發(fā)芽率比較

年份達到50%所需低溫天數/d最高發(fā)芽率/%Y1Y2Y1Y22015年91Aa71Aa64Bc66Bc2016年45Bb15Bb89Aa96Aa2017年30Bc11Bc78Ab93Ab

注：同一列不同字母表示差異顯著，大小寫字母分別代表P<0.01，P<0.05。

3.3 相關性分析結果

3.3.1 種子長度、厚度和重量與溫度的相關性 在研究溫度對黃檗種子性狀的影響時，考慮到萌芽期、花期時，種子尚未長出，所以只考察了果期、生長期的年度溫度數據對種子性狀的影響。種子長度、厚度和重量與溫度的相關性見表4。

表4 種子長度、厚度和重量與溫度的相關性

注：**表示P<0.01。

由表4可以看出，溫度對種子長度、厚度和重量均有影響。除果期平均溫差、生長期平均溫差和年平均最低溫外，各物候期溫度均與種子長度呈正相關，其中影響最大的溫度因素是果期平均最低溫與生長期平均最低溫，相關系數均達到了0.701。結果顯示年均溫度與種子長度呈正相關，這與童應鵬、胡梟劍對薏苡[4]、車前[5]的研究結果相同。果期平均最低溫與生長期平均最低溫對種子厚度影響呈負相關，相關系數為-0.612，果期平均溫差，生長期平均溫差和年平均最低溫對種子厚度的影響呈正相關，相關系數為0.583。影響種子重量的溫度因子只有生長期平均溫差與年平均最低溫，均為正相關，相關系數為0.435。

3.3.2 休眠程度與溫度的相關性 在休眠程度與溫度的相關性分析中，包含5個觀察點的全部數據，Y1與Y2觀察點的種子休眠程度見表3，Y3、Y4、Y5觀察點的種子休眠程度見表5。種子休眠程度與溫度的相關系數見表6。

表5 Y3、Y4、Y5觀察點黃檗種子休眠程度

表6 休眠程度與溫度的相關性

注：**表示P<0.01。

對種子達到50%發(fā)芽率所需低溫天數影響最大的溫度因子是萌芽期均溫、果期均溫、生長期均溫、年均溫、年平均溫差和大于20 ℃積溫，相關系數為-0.743；對黃檗種子最高發(fā)芽率影響最大的是花期積溫，相關系數為0.84，與最高發(fā)芽率呈負相關的溫度因子有花期平均溫差、果期平均溫差，生長期平均溫差和年平均最低溫。

種子達到50%發(fā)芽率所需低溫天數和最高發(fā)芽率從不同側面反映了種子的休眠程度，由表6可以看出，溫度與兩者相關系數的正負值均為相反，除溫差外，溫度因子均與休眠程度均呈顯著性負相關，這與擬南芥、紫花苜宿種子休眠程度對溫度的響應一致[6-7]。在具有顯著相關的因子中，只有花期、果期和生長期的溫差與休眠程度呈正相關，說明在溫暖的氣候條件下，種子休眠程度較淺，各物候期的溫差存在較大差異時，種子的休眠程度較深。

4 結論

除果期平均溫差、生長期平均溫差和年平均低溫外，其余溫度因子均對種子長度均有顯著性影響，說明全年溫度均對種子大小產生影響；對厚度和重量有顯著性影響的溫度因子分別只有5個和2個，且全為最低溫和溫差，說明子葉厚度與種子重量主要與最低溫和溫差有關。

Y1和Y2兩個觀察點中，三年間的休眠程度趨勢基本相同，溫度與休眠程度的相關性數據表明，各物候期積溫和均溫均與休眠程度呈負相關，說明積溫和均溫越高，休眠程度越低，在溫暖和溫差較小的氣候條件下生長的黃檗，其種子休眠程度較淺；寒冷和溫差較大的氣候條件下生長的黃檗，其種子的休眠程度較深。

5 討論

本研究選取同一觀察點不同年份的黃檗種子作為分析對象，可以單純考察不同年份間氣候因子對黃檗種子性狀的影響。課題組之前研究表明，氣候對黃檗的影響主要體現在溫度因子上[8]，現在的大多數研究中溫度數據都較為粗糙，多為年均數據或月均數據，本研究通過在樣點放置溫度檢測器，記錄樣點每日溫度，可以將年均數據細分為各物候期溫度，這樣得出的數據更具有針對性。在評價黃檗種子休眠程度時，采用了種子達到50%發(fā)芽率所需低溫層積天數和種子能達到的最高發(fā)芽率兩個指標，這兩個評價指標比大多數研究中評價休眠程度時采用的相同低溫天數處理下達到的發(fā)芽率更能客觀的反映種子的休眠程度。

目前黃檗育苗主要有春播和秋播兩種方式，春播需要沙藏低溫處理[9]。本研究表明不同年份間的黃檗種子休眠程度具有差異，生產所用種子可能取自不同地點，休眠程度差別更大，沙藏低溫處理的時間很難把握，因此建議育苗時選擇秋播。

全球氣候的變化會對不同物種的種子產生不同的影響[10]，全球變暖有利于輪葉馬先蒿種子的萌發(fā)和擴散[11]，不利于華北落葉松種群的更新[12]。黃檗產區(qū)的溫度隨著全球變暖會變得更高，這將有利于黃檗的物種繁殖，對緩解黃檗資源衰竭的狀況有利。