蘇迪，劉曉薇，陳隨清

河南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，河南 鄭州 450046

懷菊花為“四大懷藥”之一，為菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序，具有平肝明目、清熱解毒的功效[1]。懷菊花主產(chǎn)于河南省焦作地區(qū)，又以溫縣和武陟縣種植較多，化學(xué)成分主要有有機(jī)酸、黃酮類及揮發(fā)油等，《中華人民共和國藥典》2015版項(xiàng)下設(shè)綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩嶙鳛槠渲笜?biāo)成分?，F(xiàn)代藥理表明，菊花具有抗炎、降壓、抗衰老、抗腫瘤等作用[2-7]。懷菊花作為河南特有的道地藥材之一，具有很大的市場(chǎng)價(jià)值，而隨著中藥材交易的不斷變化，人們對(duì)于中藥材的廣泛認(rèn)知及應(yīng)用，中藥材的商品規(guī)格等級(jí)已然發(fā)生改變，目前市場(chǎng)上主要有大白菊、小白菊、小黃菊和珍珠菊4種商品規(guī)格的懷菊花栽培品種[8-10]。而對(duì)其商品規(guī)格等級(jí)的劃分可追溯到1984年國家中醫(yī)藥管理局與衛(wèi)生部聯(lián)合下達(dá)的《76種藥材商品規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)》，其中將懷菊花僅分為兩個(gè)等級(jí)[11]，隨著現(xiàn)代化檢測(cè)技術(shù)和科學(xué)評(píng)價(jià)方法的運(yùn)用，舊的標(biāo)準(zhǔn)已然無法滿足市場(chǎng)需求，停滯的標(biāo)準(zhǔn)研究不利于藥材市場(chǎng)的健康發(fā)展，因此急需確定新的商品標(biāo)準(zhǔn)。本課題組通過到懷菊花的產(chǎn)地和藥材市場(chǎng)進(jìn)行實(shí)地考察和走訪，收集到32批懷菊花樣品，根據(jù)文獻(xiàn)和市場(chǎng)調(diào)查結(jié)果，將懷菊花分為4個(gè)商品規(guī)格，采用內(nèi)在指標(biāo)成分對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，為懷菊花的商品規(guī)格與其質(zhì)量的內(nèi)在聯(lián)系奠定基礎(chǔ)，為懷菊花的商品規(guī)格等級(jí)的制定提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀(2998紫外檢測(cè)器)；島津UV-2600紫外分光光度計(jì)；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q Academic A10超純水機(jī)；BSA124S-分析天平(賽多利斯公司)。

1.2 試藥

綠原酸對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：16031610，純度99.39%)、木犀草苷對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：5373-11-5，純度≥98%)、3，5-O-二咖啡?；鼘幩釋?duì)照品(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：111782-201405，純度92%)；蘆丁(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：153-18-4，純度≥98%)；磷酸、甲醇、乙腈(賽默飛世爾科技有限公司，色譜純)；水為實(shí)驗(yàn)室自制重蒸水；其他試劑均為分析純。

懷菊花樣品收集于河南省武陟縣、溫縣及河北安國、四川等地，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)陳隨清教授鑒定，均為菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥頭狀花序。樣品信息見表1。

表1 懷菊花樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬暮繙y(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩釋?duì)照品適量，配制成質(zhì)量濃度為358、286、849 μg·mL-1的溶液；精密吸取各母液適量，加70%甲醇水定容，配制成一系列不同濃度的混合對(duì)照品溶液，4 ℃保存，備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取干燥的供試品，粉碎過一號(hào)篩，精密稱定0.25 g，置干燥的50 mL具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇水25 mL，精密稱定，超聲處理40 min，冷卻，用70%甲醇水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，取續(xù)濾液，過0.22 μm微孔濾膜，備用。

2.1.3 色譜條件 Waters XBridge C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫(0～11.0 min，10%～18%乙腈；11.0～30.0 min，18%～20%乙腈；30.0～40.0 min，20%乙腈)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：348 nm；進(jìn)樣量：10 μL；運(yùn)行時(shí)間：40 min，HPLC圖見圖1。

2.1.4 線性范圍考察 精密吸取不同濃度的綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩峄旌蛯?duì)照品10 μL，按上述色譜條件測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到綠原酸回歸方程Y=10 410X+1 842.2(r=0.999 8)，線性范圍為3.69～92.25 μg·mL-1；木犀草苷回歸方程Y=26 451X-22 972(r=0.999 9)，線性范圍為2.65～53.00 μg·mL-1；3，5-O-二咖啡?；鼘幩峄貧w方程Y=18 111X-320.06(r=0.999 9)，線性范圍為8.33～249.90 μg·mL-1。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 按2.1.2項(xiàng)下條件制備懷菊花供試品溶液(Y14)，精密吸取10 μL，連續(xù)測(cè)定6次，記錄峰面積，計(jì)算綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸的RSD值分別為0.92%、1.31%、1.51%，表明儀器的精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一懷菊花供試品溶液(Y14)，分別于0、2、4、8、12、24 h按2.1.3色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算得到綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬腞SD值分別為1.14%、1.52%、1.67%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批懷菊花樣品(Y14)，按2.1.2項(xiàng)下條件平行制備6份供試品溶液，按照2.1.3條件測(cè)定，計(jì)算得到綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岬腞SD值分別為1.66%、1.28%、1.97%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的懷菊花粉末(Y14)6份，精密稱定，分別加入一定量的綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩釋?duì)照品溶液，2.1.2方法制備成供試品溶液，結(jié)果見表2。

注：A.綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸混和對(duì)照品；B.大白菊樣品；C.小白菊樣品；D.小黃菊樣品；E.珍珠菊樣品；1.綠原酸；2.木犀草苷；3.3，5-O-二咖啡?；鼘幩?。圖1 懷菊花樣品HPLC圖

表2 綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡?；鼘幩峒訕踊厥章?n=6)

2.1.9 樣品含量測(cè)定 取32批懷菊花樣品溶液按2.1.2項(xiàng)下條件進(jìn)行分析，測(cè)得綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量，見表3。其中，小白菊與小黃菊符合《中華人民共和國藥典》2015版要求，大白菊的木犀草苷含量較低，不符合要求。

2.2 總黃酮含量測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品適量，用70%乙醇水定容至50 mL，搖勻，配制成質(zhì)量濃度為0.3 mg·mL-1的溶液，4 ℃保存，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品粉末(過四號(hào)篩)1 g，置于150 mL具塞錐形瓶中，加70%乙醇水30 mL，超聲提取30 min，用70%乙醇水定容至100 mL容量瓶中，過濾，即得。

2.2.3 波長(zhǎng)的選擇 吸取蘆丁對(duì)照品溶液3 mL于10 mL容量瓶中，用30%乙醇水定容，取2 mL于另一10 mL的容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min；再加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，并用30%乙醇水定容，靜置20 min后，于波長(zhǎng)200～800 nm測(cè)定吸收光譜，并確定蘆丁對(duì)照品的最大吸收波長(zhǎng)為511 nm。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 配制質(zhì)量濃度分別為0.052、0.100、0.153、0.204、0.253 mg·mL-1蘆丁對(duì)照品溶液，分別取3 mL于10 mL容量瓶中，用30%乙醇水稀釋定容，再從中吸取2 mL于另一10 mL的容量瓶中，依次加以上3種顯色劑并定容，搖勻。靜置20 min，于511 nm處測(cè)其吸光度A值。按濃度與吸光值相關(guān)關(guān)系求出回歸方程：Y=2.813 6X+0.072(r=0.999 0)，蘆丁在0.050～0.25 mg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.2.5 樣品測(cè)定 將供試品溶液用30%乙醇水定容至10 mL，吸取2 mL，依次加入3種顯色劑，靜置20 min，于511 nm處測(cè)定吸光度值，總黃酮含量測(cè)定結(jié)果見表3。

2.3 揮發(fā)油含量測(cè)定

參照《中華人民共和國藥典》2015年版四部(通則2204)揮發(fā)油測(cè)定法甲法提取揮發(fā)油。稱取懷菊花樣品50.00 g，研磨粉碎，置于2000 mL圓底燒瓶中，加入蒸餾水700 mL和沸石數(shù)粒，待揮發(fā)油量不再增加，讀取刻度，計(jì)算揮發(fā)油含量，結(jié)果見表3。

表3 32批懷菊花樣品不同成分的含量測(cè)定結(jié)果 %

2.4 不同商品規(guī)格懷菊花化學(xué)成分的系統(tǒng)聚類分析

對(duì)32批懷菊花5個(gè)化學(xué)成分含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，利用SPSS20.0分析軟件，采用Ward法進(jìn)行聚類分析，聚類樹狀圖見圖2。

圖2 懷菊花樣品化學(xué)成分含量聚類圖

樹狀圖顯示，32批懷菊花樣品中，大白菊、小白菊可各聚為一類，小黃菊和珍珠菊可聚為一大類。

2.5 懷菊花化學(xué)成分的SPSS方差分析

本研究運(yùn)用SPSS20.0分析軟件對(duì)懷菊花4個(gè)商品規(guī)格的5個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行方差分析，并采用字母標(biāo)記法進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見表4。

從綠原酸含量分析，大白菊>小白菊>小黃菊>珍珠菊，且珍珠菊與其他3個(gè)規(guī)格具極顯著性差異，且含量不符合2015版《中華人民共和國藥典》要求；從木犀草苷含量分析，珍珠菊>小白菊>小黃菊>大白菊，大白菊與小白菊和珍珠菊具有極顯著性差異，但大白菊含量不符合2015版《中華人民共和國藥典》要求；從3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷糠治?，大白菊>小白菊>小黃菊>珍珠菊，除大白菊與小白菊無顯著性差異外，其他各規(guī)格間均具有極顯著性差異，珍珠菊含量不符合2015版《中華人民共和國藥典》要求；從總黃酮含量分析，大白菊與小黃菊、小白菊與小黃菊間具有顯著性差異，其他規(guī)格無顯著性差異；從揮發(fā)油含量分析，大白菊分別與小白菊和小黃菊具有極顯著性差異，小白菊與小黃菊具有極顯著性差異。

表4 不同商品規(guī)格懷菊花方差分析多重比較結(jié)果 %

注：含有相同字母間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，含有不同字母間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

懷菊花主產(chǎn)于河南焦作地區(qū)，《中華人民共和國藥典》2015版將其收錄于菊花項(xiàng)下，而懷菊花在市場(chǎng)上流通的商品規(guī)格有大白菊、小白菊、小黃菊和珍珠菊4種，且均為栽培品種[8]。由于懷菊花栽培品種和采收加工方式的不同，導(dǎo)致其形態(tài)特征和質(zhì)量發(fā)生了較大的變化[9，12]。鑒于以上問題，本研究參考2015版《中華人民共和國藥典》菊花項(xiàng)下的含量測(cè)定項(xiàng)，以綠原酸、木犀草苷、3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸、總黃酮和揮發(fā)油為指標(biāo)，對(duì)不同商品規(guī)格的懷菊花進(jìn)行了測(cè)定，在32批懷菊花樣品中，小白菊和小黃菊均符合2015版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，8批大白菊的木犀草苷含量不符合2015版《中華人民共和國藥典》規(guī)定。大白菊是懷菊花的傳統(tǒng)栽培品種，舌狀花較少，管狀花多，在市場(chǎng)流通過程中花瓣容易散落，導(dǎo)致其品相不佳，再加上目前大白菊的產(chǎn)量也很小，因此其是否被淘汰需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。珍珠菊的綠原酸及3，5-O-二咖啡酰基奎寧酸含量明顯較其他3種規(guī)格低，均不符合2015版《中華人民共和國藥典》要求。在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，珍珠菊主要以茶飲的形式在市場(chǎng)上流通，為未開放的花蕾，性狀與2015版《中華人民共和國藥典》的描述也不相符，因此不是懷菊花的藥用品種。

以5個(gè)化學(xué)成分的含量為指標(biāo)，對(duì)懷菊花的5種商品規(guī)格進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，大白菊和小白菊可各自聚為一類，小黃菊與珍珠菊聚為一類，這與它們的親緣關(guān)系相一致，珍珠菊也屬于黃色菊花類，雖然小黃菊符合2015版《中華人民共和國藥典》要求，為藥用菊花的一個(gè)規(guī)格，但是在產(chǎn)地更習(xí)慣用于茶飲。對(duì)不同商品規(guī)格懷菊花進(jìn)行方差分析發(fā)現(xiàn)，各個(gè)規(guī)格之間存在顯著性的差異，說明在同一個(gè)生長(zhǎng)地區(qū)，不同品種之間存在著差異。2015版《中華人民共和國藥典》含量測(cè)定項(xiàng)下，小白菊成分含量較小黃菊高，在化學(xué)成分含量上優(yōu)于小黃菊，這與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致。