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        栽培甘草的化學(xué)成分及其抗菌活性研究△

        2019-07-03 01:52:04包芳白海英彭靜文魏冠華王麗瑤鄧庭偉王繼永劉映前楊志剛
        中國現(xiàn)代中藥 2019年5期
        關(guān)鍵詞:分子式三氯甲烷異黃酮

        包芳,白海英,彭靜文,魏冠華,王麗瑤,鄧庭偉,王繼永,劉映前,楊志剛*

        1.蘭州大學(xué) 藥學(xué)院,甘肅 蘭州 730030;2.中國中藥有限公司,北京 102600

        甘草來源于豆科甘草屬植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.、光果甘草G.glabraL.和脹果甘草G.inflataBat.的根及根莖[1]。目前,栽培甘草已成為甘草商品的主要來源[2],已從甘草中分離鑒定出400多種化學(xué)成分[3]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,甘草具有保肝、抗炎、抗氧化、抗癌、抗腫瘤和抗菌等多種藥理作用[4-5]。就抗菌活性而言,甘草不僅對人體致病菌有抑制活性,而且對農(nóng)業(yè)植物病原菌也有抑制作用[6-7]。

        本實(shí)驗(yàn)從栽培甘草中分離出14個(gè)化合物,分別鑒定為7-O-甲基羽扇豆異黃酮(7-O-methylluteone,1)、(R)-(-)-驢食草酚[(R)-(-)-vestitol,2]、紅花巖黃芪香豆雌酚B(hedysarimcoumestan B,3)、山柰酚(kaempferol,4)、毛蕊異黃酮(calycosin,5)、甘草查爾酮B(licochalcone B,6)、7,2′,4′-三羥基-5-甲氧基-3-芳香豆素(7,2′,4′-trihydroxy-5-methoxy-3-arylcoumarin,7)、3,3′,4,4′-四羥基-2-甲氧基查爾酮(3,3′,4,4′-tetrahydroxy-2-methoxychalcone,8)、glycyrrhisoflavanone(9)、甘草素(liquiritigenin,10)、半甘草異黃酮B(semilicoisoflavone B,11)、isoangustone A(12)、粗毛甘草素C(glyasperin C,13)和白樺脂酸(betulinic acid,14),并對化合物10~13進(jìn)行了抗菌活性研究,旨在進(jìn)一步合理利用甘草資源,開發(fā)安全、綠色和無污染的植物源殺菌劑。

        1 儀器與材料

        AVANCE AV III-400核磁共振波譜儀(瑞士布魯克公司);超高效二維液相色譜儀-氣相譜儀-四級桿飛行時(shí)間離子淌度質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司);半制備型高效液相色譜儀(江蘇漢邦科技有限公司);制備型色譜柱(COSMOSIL-pack ODS 250 mm×10 mm,10 μm);Sephadex LH-20(GE Healthcare公司);薄層色譜硅膠GF254和柱色譜硅膠(200~300目,青島海洋化工有限公司);D(+)-無水葡萄糖(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);瓊脂(北京索萊寶科技有限公司);所用試劑均為分析純(天津市富宇精細(xì)化工有限公司);植物病原菌菌種于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育。

        甘草藥材于2016年10月采自甘肅省武威市民勤縣,經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院馬志剛教授鑒定為甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根莖,標(biāo)本(MQG201610)存放于蘭州大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

        2 提取與分離

        稱取甘草藥材10 kg,經(jīng)干燥、切碎后,用80%乙醇水浸泡3次,每次24 h,合并濾液,減壓濃縮蒸餾得乙醇浸膏,加適量水混懸,分別用等體積的三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次,得到三氯甲烷提取物142 g,乙酸乙酯提取物48 g,正丁醇提取物240 g。

        取乙酸乙酯提取物46 g,用硅膠柱色譜分離,采用石油醚-乙酸乙酯(100∶1~0∶100)梯度洗脫,得到5部分(Fr.A~E),F(xiàn)r.B用開放ODS柱色譜(甲醇-水)梯度洗脫,得到14個(gè)部分(Fr.B1~14),F(xiàn)r.B13經(jīng)硅膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇)梯度洗脫和半制備HPLC(75%甲醇水)純化,得到化合物1(3.8 mg)和12(61.4 mg)。Fr.B12經(jīng)硅膠柱色譜(三氯甲烷-丙酮)梯度洗脫和半制備HPLC(70%甲醇水)純化,得到化合物10(25.0 mg)、11(28.0 mg)和13(15.0 mg)。Fr.B9依次通過硅膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇)梯度洗脫、Sephadex LH-20[三氯甲烷-甲醇(1∶1)]等度洗脫和制備型HPLC(65%甲醇水)純化,得到化合物2(11.0 mg)、3(5.0 mg)和4(4.5 mg)。Fr.C經(jīng)硅膠柱色譜(三氯甲烷-甲醇)梯度洗脫分離,得到8個(gè)部分(Fr.C1~8),F(xiàn)r.C6依次經(jīng)開放ODS柱色譜(甲醇-水)梯度洗脫和制備型HPLC(65%甲醇水)純化,得到化合物6(10.0 mg)、7(9.0 mg)和8(8.0 mg)。Fr.C4依次經(jīng)sephadex LH-20[三氯甲烷-甲醇(1∶1)]等度洗脫和制備型HPLC(70%甲醇水)純化,得到化合物5(8.7 mg)和9(6.0 mg)。

        取三氯甲烷提取物140 g用硅膠柱色譜分離,石油醚-乙酸乙酯(100∶1~0∶100)梯度洗脫,得到10個(gè)部分(Fr.1~10),F(xiàn)r.4通過硅膠柱色譜(石油醚-丙酮)梯度洗脫分離和重結(jié)晶得到化合物14(6.8 mg)。

        3 結(jié)構(gòu)與鑒定

        化合物1:黃色粉末。分子式C21H20O6;ESI-MSm/z:369.132 6[M+H]+;1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:8.24(1H,s,H-2),6.72(1H,s,H-8),6.37(1H,d,J=2.0 Hz,H-3′),6.27(1H,dd,J=2.4,8.4 Hz,H-5′),6.97(1H,d,J=8.4 Hz,H-6′),3.25(2H,d,J=6.8 Hz,H-1″),5.13(1H,t,J=6.8 Hz,H-2″),1.72(3H,s,H-4″),1.61(3H,s,H-5″),3.91(3H,s,7-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[8],故鑒定化合物1為7-O-甲基羽扇豆異黃酮。

        化合物2:黃色粉末。分子式C16H16O4;ESI-MSm/z:273.111 4[M+H]+;1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:6.85(1H,d,J=8.4 Hz,H-5),6.28(1H,dd,J=2.4,8.4 Hz,H-6),6.18(1H,d,J=2.4 Hz,H-8),6.41(1H,d,J=2.0 Hz,H-3′),6.34(1H,dd,J=2.0,8.0 Hz,H-5′),6.97(1H,d,J=8.0 Hz,H-6′),4.13(1H,ddd,J=2.0,3.2,10.4 Hz,Heq-2),3.90(1H,dd,J=10.4,10.4 Hz,Hax-2),3.68(3H,s,4′-OCH3),3.32(1H,ddd,J=11.2,10.4,3.0 Hz,Hax-3),2.87(1H,dd,J=15.6,11.2 Hz,Hax-4),2.71(1H,dd,J=15.6,3.6 Hz,Heq-4);13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:29.7(C-4),31.1(C-3),54.8(4′-OCH3),69.2(C-2),101.3(C-3′),102.5(C-8),104.3(C-5′),107.9(C-6),112.7(C-10),119.7(C-1′),127.7(C-6′),130.0(C-5),154.6(C-9),155.8(C-2′)156.4(C-7),158.8(C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[9],故鑒定化合物2為(R)-(-)-驢食草酚。

        化合物3:黃色粉末。分子式C16H10O6;ESI-MSm/z:299.054 6[M+H]+;1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:7.68(1H,d,J=8.4 Hz,H-6′),7.12(1H,s,H-3′),6.93(1H,d,J=8.4 Hz,H-5′),6.50(1H,s,H-8),6.50(1H,s,H-6),3.97(3H,s,4-OCH3);13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:155.5(C-5),96.3(C-6),95.9(C-8),155.8(C-9),156.7(C-2),101.1(C-3),114.3(C-1′),120.3(C-6′),113.9(C-5′),157.5(C-4′),98.5(C-3′),156.7(C-2′),159.3(C-4),95.9(C-10),56.4(4-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[10],故鑒定化合物3為紅花巖黃芪香豆雌酚B。

        化合物4:黃色粉末。分子式C15H10O6;ESI-MSm/z:287.054 7[M+H]+;1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:6.19(1H,br s,H-6),6.43(1H,br s,H-8),6.93(2H,d,J=8.4 Hz,H-3′,5′),8.04(2H,d,J=8.4 Hz,H-2′,6′),12.48(1H,s,5-OH);13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:146.8(C-2),135.7(C-3),175.9(C-4),160.7(C-5),98.2(C-6),164.1(C-7),93.5(C-8),156.2(C-9),103.0(C-10),121.7(C-1′),129.5(C-2′),115.4(C-3′),159.2(C-4′),115.4(C-5′),129.5(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[11],故鑒定化合物4為山柰酚。

        化合物5:白色粉末。分子式C16H12O5;ESI-MSm/z:285.075 9[M+H]+;1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:6.87(1H,d,J=2.2 Hz,H-8),6.94(1H,dd,J=8.8,2.2 Hz,H-6),7.97(1H,d,J=8.8 Hz,H-5),7.01(1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),6.93(1H,d,J=2.5 Hz,H-2′),7.05(1H,dd,J=8.0,2.5 Hz,H-6′),8.29(1H,s,H-2),3.79(3H,s,4′-OCH3);13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:153.1(C-2),124.7(C-3),174.6(C-4),127.3(C-5),115.2(C-6),162.6(C-7),102.1(C-8),157.4(C-9),116.6(C-10),123.4(C-1′),112.0(C-2′),146.0(C-3′),147.5(C-4′),116.5(C-5′),119.7(C-6′),55.7(4′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[12],故鑒定化合物5為毛蕊異黃酮。

        化合物6:棕黃色結(jié)晶。分子式C16H14O5;ESI-MSm/z:287.090 8[M+H]+;1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:3.77(3H,s,2-OCH3),7.33(1H,d,J=7.6 Hz,H-6),6.63(1H,d,J=7.6 Hz,H-5),6.89(2H,d,J=6.0 Hz,H-3′,5′),8.00(2H,d,J=7.6 Hz,H-2′,6′),7.67(1H,d,J=15.6 Hz,H-α),7.85(1H,d,J=15.6 Hz,H-β);13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:138.4(C-β),119.1(C-α),187.3(C=O),115.4(C-3′,5′),162.0(C-4′),130.9(C-2′,6′),129.6(C-1′),119.5(C-1),148.6(C-2),138.3(C-3),149.8(C-4),111.8(C-5),118.6(C-6),60.8(2-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[13],故鑒定化合物6為甘草查爾酮B。

        化合物7:黃色粉末。分子式C16H12O6;ESI-MSm/z:301.070 2[M+H]+;1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:7.85(1H,s,H-4),6.34(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.35(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),6.34(1H,d,J=2.4 Hz,H-3′),6.25(1H,dd,J=2.4,8.4 Hz,H-5′),7.06(1H,d,J=8.4 Hz,H-6′),3.85(3H,s,5-OCH3);13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:160.3(C-2),136.1(C-4),119.1(C-3),156.8(C-5),95.3(C-6),161.7(C-7),94.5(C-8),155.4(C-9),106.3(C-10),113.6(C-1′),156.0(C-2′),102.5(C-3′),158.3(C-4′),102.7(C-5′),131.5(C-6′),56.1(5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[14],故鑒定化合物7為7,2′,4′-三羥基-5-甲氧基-3-芳香豆素。

        化合物8:黃色結(jié)晶。分子式C16H14O6;ESI-MSm/z:303.085 6[M+H]+;1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:3.77(3H,s,2-OCH3),7.29(1H,d,J=8.0 Hz,H-6),6.63(1H,d,J=8.0 Hz,H-5),6.85(1H,d,J=8.0 Hz,H-5′),7.48(1H,dd,J=2.0,8.0 Hz,H-6′),7.54(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),7.62(1H,d,J=15.6 Hz,H-α),7.80(1H,d,J=15.6 Hz,H-β);13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:138.0(C-β),119.2(C-α),187.4(C=O),130.1(C-1′),121.7(C-6′),115.3(C-2′),115.2(C-5′),145.5(C-3′),150.7(C-4′),119.6(C-1),148.6(C-2),138.4(C-3),149.6(C-4),111.8(C-5),118.6(C-6),60.8(2-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[15],故鑒定化合物8為3,3′,4,4′-四羥基-2-甲氧基查爾酮。

        化合物9:白色粉末。分子式C21H20O6;ESI-MSm/z:369.132 7[M+H]+;1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:1.34(2H,s,H-4″,5″),3.57(1H,t,J=5.6 Hz,H-3),4.48(2H,br d,J=5.6 Hz,H-2),6.05(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),5.94(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),6.54(1H,d,J=1.6 Hz,H-2′),6.41(1H,d,J=1.6 Hz,H-6′),6.28(1H,d,J=10.0 Hz,H-1″),5.69(1H,d,J=10.0 Hz,H-2″);3.71(3H,s,5-OCH3),13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:27.5(C-5″),27.5(C-4″),75.7(C-3″),131.2(C-2″),122.1(C-1″),128.7(C-1′),116.3(C-2′),145.2(C-3′),139.0(C-4′),121.4(C-5′),116.8(C-6′),70.3(C-2),51.3(C-3),187.9(C-4),162.6(C-5),95.3(C-6),164.3(C-7),93.3(C-8),164.1(C-9),104.3(C-10),55.6(5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[16],故鑒定化合物9為glycyrrhisoflavanone。

        化合物10:淡黃色粉末。分子式C15H12O4;ESI-MSm/z:257.080 2[M+H]+;1H-NMR[400 MHz,(CD3)2CO]δ:5.45(1H,dd,J=2.8,13.0 Hz,H-2),3.06(1H,dd,J=13.0,17.0 Hz,H-3α),2.68(1H,dd,J=2.8,17.0 Hz,H-3β),7.74(1H,d,J=8.8 Hz,H-5),6.58(1H,dd,J=2.4,8.8 Hz,H-6),6.43(1H,d,J=2.4 Hz,H-8),7.41(2H,d,J=8.8 Hz,H-2′,6′),6.90(2H,d,J=8.8 Hz,H-3′,5′);13C-NMR[100 MHz,(CD3)2CO]δ:79.7(C-2),43.8(C-3),189.8(C-4),128.7(C-5),110.4(C-6),163.7(C-7),102.9(C-8),164.4(C-9),114.4(C-10),130.5(C-1′),128.2(C-2′),115.3(C-3′),157.8(C-4′),115.3(C-5′),128.2(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[17],故鑒定化合物10為甘草素。

        化合物11:淡黃色粉末。分子式C20H16O6;ESI-MSm/z:353.102 0[M+H]+;1H-NMR(400 MHz,(CD3)2CO)δ:8.18(1H,s,H-2),6.28(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),6.41(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),6.83(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),7.01(1H,d,J=2.0 Hz,H-6′),6.41(1H,d,J=9.6 Hz,H-1″),5.76(1H,d,J=9.6 Hz,H-2″),1.43(3H,s,H-4″),1.43(3H,s,H-5″);13C-NMR[100 MHz,(CD3)2CO]δ:153.7(C-2),122.1(C-3),180.6(C-4),163.1(C-5),99.0(C-6),164.1(C-7),93.6(C-8),158.1(C-9),105.3(C-10),122.7(C-1′),122.1(C-2′),145.3(C-3′),140.1(C-4′),121.5(C-5′),118.0(C-6′),116.6(C-1″),131.2(C-2″),76.6(C-3″),27.1(C-4″),27.1(C-5″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[17],故鑒定化合物11為半甘草異黃酮B。

        化合物12:白色粉末。分子式C25H26O6;ESI-MSm/z:423.178 9[M+H]+;1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:8.22(1H,s,H-2),6.43(1H,s,H-8),6.88(1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),6.65(1H,d,J=2.0 Hz,H-6′),5.16(1H,t,J=6.8 Hz,H-3″),3.23(2H,d,J=6.4 Hz,H-1″),1.61(3H,s,H-4″),3.23(2H,d,J=6.4 Hz,H-1?),5.28(1H,t,J=6.8 Hz,H-3?),1.66(3H,s,H-4?),1.66(3H,s,H-5″),1.71(3H,s,H-5?);13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:153.7(C-2),121.1(C-3),180.3(C-4),158.8(C-5),111.0(C-6),161.9(C-7),92.9(C-8),155.3(C-9),104.3(C-10),123.1(C-1′),120.5(C-2′),144.5(C-3′),143.1(C-4′),128.0(C-5′),114.0(C-6′),21.0(C-1″),122.5(C-2″),130.9(C-3″),17.7(C-4″),25.5(C-5″),28.3(C-1?),122.2(C-2?),131.7(C-3?),17.7(C-4?),25.6(C-5?)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[18],故鑒定化合物12為isoangustone A。

        化合物13:黃色粉末。分子式C21H24O5;ESI-MSm/z:357.168 5[M+H]+;1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:6.86(1H,d,J=8.0 Hz,H-6′),6.32(1H,d,J=2.4 Hz,H-3′),6.18(1H,dd,J=2.4,8.0 Hz,H-5′),4.10(1H,brd,J=8.0 Hz,H-2),3.86(1H,t,J=8.0 Hz,H-2),3.20(3H,m,H-3),2.69(1H,m,H-4),3.14(1H,m,H-4),6.08(1H,s,H-8),3.42(2H,d,J=6.0 Hz,H-1″),5.13(1H,t,J=6.0 Hz,H-2″),1.69(3H,s,H-4″),1.61(3H,s,H-5″),3.60(3H,s,5-OCH3),9.34(1H,s,OH),9.15(1H,s,OH),9.09(1H,s,OH),13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:117.9(C-1′),155.8(C-2′),102.5(C-3′),156.8(C-4′),106.2(C-5′),127.5(C-6′),69.1(C-2),30.7(C-3),25.5(C-4),156.8(C-5),113.1(C-6),154.4(C-7),98.6(C-8),152.9(C-9),106.7(C-10),22.3(C-1″),124.2(C-2″),129.2(C-3″),17.7(C-4″),25.4(C-5″),59.9(5-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[19],故鑒定化合物13為粗毛甘草素C。

        化合物14:白色粉末。分子式C30H48O3;ESI-MSm/z:455.354 1[M-H]﹣;1H-NMR(400 MHz,pyridine-d5)δ:0.80(3H,s,H-25),0.99(3H,s,H-27),1.04(3H,s,H-24),1.05(3H,s,H-26),1.20(3H,s,H-23),1.77(3H,s,H-30),2.23(1H,m),2.62(2H,dt,J=9.2,3.2 Hz,H-19),2.72(1H,td,J=2.4,11.2 Hz,H-6),3.43(1H,t,J=8.0 Hz),3.53(1H,m),4.75(1H,s,H-29),4.92(1H,d,J=2.4 Hz,H-29);13C-NMR(100 MHz,pyridine-d5)δ:39.3(C-1),28.4(C-2),78.1(C-3),39.5(C-4),55.9(C-5),18.5(C-6),34.5(C-7),41.1(C-8),51.0(C-9),37.6(C-10),21.4(C-11),26.0(C-12),39.0(C-13),42.8(C-14),31.4(C-15),32.8(C-16),56.6(C-17),47.9(C-18),50.1(C-19),151.4(C-20),30.5(C-21),37.5(C-22),28.6(C-23),16.3(C-24),16.4(C-25),16.6(C-26),14.9(C-27),178.8(C-28),110.0(C-29),19.5(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[20],故鑒定化合物14為白樺脂酸。

        4 抗菌活性篩選

        本實(shí)驗(yàn)采用菌絲生長速率法。稱取待測化合物溶解于適量二甲基亞砜(DMSO)中,將其加入無菌PDA培養(yǎng)基使化合物濃度為100 μg·mL-1,以DMSO為空白對照。待培養(yǎng)基冷卻后,從活化后的菌種中取菌餅(d=5 mm)并接種于培養(yǎng)基,置于(25±1)℃環(huán)境恒溫培養(yǎng),待對照菌絲生長至培養(yǎng)皿約2/3,取出測量菌絲生長直徑(mm)。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù),計(jì)算平均抑制率,菌絲生長抑制率按公式(1)計(jì)算。

        菌絲生長抑制率=

        (1)

        數(shù)據(jù)處理用Excel辦公軟件,數(shù)據(jù)分析使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件,用Duncan法進(jìn)行多重比較,結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,半甘草異黃酮B(11)和粗毛甘草素C(13)在100 μg·mL-1質(zhì)量濃度下,對農(nóng)業(yè)菌具有較高的抑制率,尤其對立枯絲核菌抑制效果最好,這為研發(fā)新型農(nóng)藥提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。

        表1 化合物10~13對4種農(nóng)業(yè)菌的抑制率 %

        注:與空白對照組相比,**P<0.01;—表示未進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

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