張若男，田曉清，陸亞男，樊成奇，張 靜，楊 橋，張曉玲

（1．哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，哈爾濱 150076；2．浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022；3．中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；4．舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，浙江舟山 316021）

赤潮（harmful algal blooms，HABs）是全球性海洋生態(tài)災(zāi)害及重大環(huán)境問題［1］，其可引發(fā)麻痹性貝類毒素（paralytic shellfish poisoning，PSP）等多種生物毒素并通過食物鏈傳遞而嚴(yán)重危害人體生命健康［2］?，F(xiàn)有研究表明，部分海洋甲藻、淡水藍(lán)藻及海洋細(xì)菌均可產(chǎn)生PSP，但其來源問題尚 無 定 論［3］。藻 菌 關(guān) 系 （algae-bacterial interaction）是揭示PSP產(chǎn)生機(jī)制的關(guān)鍵，而藻際（phycosphere）及藻內(nèi)定植著獨(dú)特的細(xì)菌群落并與藻間形成了復(fù)雜的微生態(tài)關(guān)系，藻共附生菌群多樣性信息的揭示及其可培養(yǎng)菌株的獲得是解析藻菌關(guān)系的首要前提［4］。微小亞歷山大藻（Alexandrium minutum）是一種全球廣布性的代表性赤潮原因藻［5］，亦是產(chǎn)生石房蛤毒素（saxitoxin，STX）等多種PSP的主要海洋甲藻，但目前對其共附生菌群尚缺乏系統(tǒng)性研究［6-7］。本文通過高通量測序首次解析了產(chǎn)PSP微小亞歷山大藻amtk-4共附生菌群的物種種類及其相對豐度，比較了不同生長時期amtk-4的可培養(yǎng)細(xì)菌種類及數(shù)量差異，對其中獲得的產(chǎn)毒新種Z1-D的PSP合成基因sxtA1進(jìn)行了基因進(jìn)化分析，以期為后續(xù)順利開展藻菌關(guān)系研究、闡析PSP來源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 藻培養(yǎng)

微小亞歷山大藻amtk-4由臺灣大學(xué)周宏農(nóng)教授提供，分離自中國臺灣東南海域［8］。使用f／2培養(yǎng)基培養(yǎng)，光照強(qiáng)度：4 500～5 000 lx，光照周期：12L／12D，培養(yǎng)溫度25℃。待藻細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取50 mL藻液于6 000 r·min-1離心收集藻細(xì)胞，使用50 mL PBS緩沖液（pH 7．2）洗滌細(xì)胞沉淀3次后備用［9-10］。

1．2 基因組DNA抽提及PCR擴(kuò)增

使用 Stool DNA Kit試劑盒（美國OMEGA）提取樣品總基因組DNA，具體操作參照試劑盒說明書進(jìn)行［11］。對提取到的樣品基因組DNA用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴(kuò)增：針對細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)設(shè)計含barcode特異性引物338F／806R，引物序列分別為338F：5′ACTCCTACGGGAGGCAGCAG3′，806R：5′GGACTACHVGGGTWTCTAAT3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)參照文獻(xiàn)［9-10］進(jìn)行，將所獲得的PCR產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物。

1．3 Illumina MiSeq高通量測序

將回收后的PCR產(chǎn)物送樣至上海美吉生物，進(jìn)行Illumina Miseq文庫構(gòu)建及高通量測序。測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制參照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行：根據(jù)PE讀長之間相互重疊關(guān)系進(jìn)行序列拼接，同時對讀長質(zhì)量和拼接效果進(jìn)行質(zhì)控分析。過濾讀長尾端質(zhì)量值小于20的堿基；最小重疊長度10 bp；拼接序列重疊區(qū)允許最大錯配比率0．2；根據(jù)序列兩端DNA條形碼及引物進(jìn)行樣品區(qū)分；軟件：FLASH及Trimmomatic。

1．4 測序數(shù)據(jù)分析

對獲得的非重復(fù)序列進(jìn)行操作分類學(xué)單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析以獲得OTU代表序列，從中選取與代表序列相似度大于97%的序列產(chǎn)生OTU數(shù)據(jù)表。通過貝葉斯分類算法（ribosomal database project，RDP）對 OTU數(shù)據(jù)表進(jìn)行分類學(xué)分析，分別在不同分類水平上進(jìn)行樣本群落組成統(tǒng)計分析［9-11］。選取 Silva、RDP、Greengene為細(xì)菌 16S比對數(shù)據(jù)庫，使用Qiime平臺與RDPClassifier分別作為計算軟件及算法，設(shè)定0．7為置信度閾值。群落豐富度指數(shù)（community richness）采用 Chao指數(shù)和 ACE指數(shù)；群落多樣性指數(shù)（community diversity）采用Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)。利用不同測序深度時微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建測序樣品的稀釋曲線（rarefaction curve）［12］。

1．5 Amtk-4可培養(yǎng)菌株分離及分子鑒定

取1 mL各個生長周期amtk-4藻培養(yǎng)液，6 000 r·min-1離心收集藻細(xì)胞，細(xì)胞沉淀用無菌海水重懸，置于冰浴中通過超聲波儀（Fisher Scientific 50，Thermo Fisher）60%功率超聲 30 s，用無菌海水依次進(jìn)行10倍梯度稀釋，取100μL稀釋液均勻涂布于不同選擇性培養(yǎng)基平板上，細(xì)菌選擇性分離培養(yǎng)基包括：2216E、ISP 4號培養(yǎng)基、M2甘油培養(yǎng)基及HV培養(yǎng)基，置于15～28℃培養(yǎng)5～10 d。待生長出細(xì)菌菌落后，挑取單菌落進(jìn)行劃線分離與純化。細(xì)菌形態(tài)的透射電鏡觀察參考文獻(xiàn)［9-11］進(jìn)行。

將5 mL對數(shù)生長期細(xì)菌培養(yǎng)物按照DNA提取試劑盒說明書步驟［9］進(jìn)行細(xì)菌DNA的提取。使用細(xì)菌通用引物27F及1492R，PCR擴(kuò)增參照文獻(xiàn)［9-11］進(jìn)行。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測［10］。PCR產(chǎn)物送樣至上海美吉進(jìn)行測序，將獲得的16S rRNA基因序列通過Ezbiocloud在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行細(xì)菌模式種16SrRNA基因序列同源性比對［9-10］。

1．6 菌株sxtA1基因進(jìn)化分析

利用Glimmer 3．02軟件對Z1-D基因組數(shù)據(jù)中的功能基因進(jìn)行預(yù)測［13］，獲得預(yù)測基因注釋信息。利用NCBI-Blast程序?qū)δ康幕蛐蛄羞M(jìn)行同源性搜索及比對，利用MEGA7．1軟件構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹［9-11］。

1．7 PSP毒素提取及LC-MS分析

參照文獻(xiàn)［9-11］，取對數(shù)生長期發(fā)酵液1 L，6 000 r·min-1離心5 min獲得細(xì)胞，獲得的細(xì)胞沉淀放入-80℃冰箱凍融3次，用pH2．0的80%乙醇溶液超聲提取3次，合并提取液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后，用30%甲酸銨溶液和70%酸化乙腈溶解，參照文獻(xiàn)［7］進(jìn)行PSP的LC-MS分析。分析條件：色譜分析柱：TSK-Gel Amide-80，2．0 mm×250 mm，5μm粒徑；流動相 A：甲酸銨緩沖溶液，B：酸化乙腈，梯度洗脫；流速：0．25 mL·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL；質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；噴霧電壓：4 500 V；離子傳輸毛細(xì)管溫度：300℃；錐孔電壓：-10 V；霧化氣流速：11．7 L·min-1；輔助氣流速：1．7 L·min-1；碰撞氣壓力：1．5 m Torr。PSP標(biāo)準(zhǔn)品石房蛤毒素（STX）購自加拿大海洋生物研究所。

2 結(jié)果與分析

2．1 Amtk-4共附生菌多樣性分析

微小亞歷山大藻amtk-4共附生菌多樣性高通量測序質(zhì)控結(jié)果如表1所示。由樣品多樣性指數(shù)包括ACE指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)數(shù)據(jù)可見，amtk-4測序樣品包含豐富的共附生菌多樣性。由樣品稀釋曲線（圖1-a）及Shannon-Wiener曲線（圖1-b）可見，隨測序數(shù)據(jù)量的增加，曲線斜率逐漸降低并趨向平坦，表明測序數(shù)據(jù)量合理，樣品測序質(zhì)量較好。

高通量測序結(jié)果表明，微小亞歷山大藻amtk-4共附生菌包括85個OTU，其中包括10個門、20個綱、40個目、59個科及87個屬?；贠TU的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹見圖2。在門水平包括變形菌 （60．0%）、硬壁菌 （14．4%）、擬桿菌（11．1%）、浮霉?fàn)罹?．4%）、放線菌（4．4%）、綠彎 菌 （2．2%）、芽 單 胞 菌 （1．1%）與Verrucomicrobia SHA-109（1．1%）。綱水平以 α-變形菌（35．6%）、γ-變形菌（22．2%）和芽孢桿菌（13．3%）占優(yōu)勢，而 β-變形菌（4．6%）、纖維粘網(wǎng)菌（4．4%）、放線菌（4．4%）、Flavobacteriia（3．3%）及浮霉?fàn)罹?．2%）所占比例較低。目水平以紅細(xì)菌（11．1%）、根瘤菌（8．7%）、芽孢桿菌（8．7%）、紅螺菌（7．8%）及交替單胞菌（7．8%）占優(yōu)勢?？扑揭约t桿菌（10．9%）、紅螺菌（7．6%）及交替單胞菌（7．6%）占優(yōu)勢。

其中優(yōu)勢屬（＞5%）6個，包括Phycisphaeraceae科未鑒定屬（11．8%）、Muricauda屬（10．3%）、腐螺旋菌科未鑒定屬（9．1%）、Hyphomonadaceae科未鑒定屬（8．9%）、Haliea屬（5．7%）及紅桿菌科未鑒定屬（5．1%）（圖3）。amtk-4來源共附生菌群中的未鑒定屬比例高達(dá)53．4%，表明微小亞歷山大藻amtk-4具有發(fā)現(xiàn)藻際生境微生物新種（屬）的巨大潛力，非常值得對其進(jìn)行進(jìn)一步深入發(fā)掘研究。

表1 測序樣品的多樣性指數(shù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計表Tab．1 Alpha-diversity data of high-throughput sequencing samples

圖1 測序樣品稀釋曲線（a）與Shannon-Wiener曲線（b）圖Fig．1 Rarefaction（a）and Shannon-Wiener curves（b）of the sample

圖2 基于OTU的微小亞歷山大藻amtk-4共附生菌群系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig．2 Phylogenetic tree of the bacterial community associated with A．minutum amtk-4 based on OTU

圖3 微小亞歷山大藻amtk-4共附生菌群多樣性的屬水平分布圖Fig．3 Microbial distribution at genus level of the associated bacterial community of A．minutum amtk-4

2．2 amtk-4可培養(yǎng)菌株16S r RNA系統(tǒng)發(fā)育分析

從微小亞歷山大藻amtk-4不同生長期所分離的細(xì)菌數(shù)量比較數(shù)據(jù)見表2。由表2可見，藻生長延緩期所獲得細(xì)菌種類及數(shù)量較少；進(jìn)入對數(shù)生長期后，細(xì)菌數(shù)量及種類增加；穩(wěn)定期細(xì)菌種類最多；進(jìn)入衰亡期后，細(xì)菌數(shù)量及種類均減少。對14株可培養(yǎng)細(xì)菌經(jīng)排重后，發(fā)現(xiàn)包括5株細(xì)菌，分別為 Thalassobaculum sp．、Muricauda sp．、Mesorhizobium sp．、亞硫酸桿菌（Sulfitobacter）及Microbacterium sp．，其中菌株Z1-D及Z1-4的16S rRNA基因序列與已有模式種的同源性最高值分別為97．8%及97．3%，其16S rRNA基因鄰接法（neighbor-joining）系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4，將其分別鑒定為亞硫酸桿菌屬及Mesorhizobium屬新種。對Z1-D菌株的發(fā)酵代謝產(chǎn)物進(jìn)行了LC-MS分析（圖5），發(fā)現(xiàn)其可產(chǎn)生約 12．6 ng·mL-1石房蛤毒素（STX）產(chǎn)物。

2．3 sxtA1基因進(jìn)化分析

SxtA是催化STX生物合成的關(guān)鍵起始基因，包括4個結(jié)構(gòu)域（sxtAZ1-4，圖6），其中 sxtA1為腺苷甲硫氨酸依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶（Methyltransferase，MTF）［5］。通過 GenBank Blast分析對Z1-D菌株的全基因組序列進(jìn)行了比對。結(jié)果表明，該菌株基因組中含有sxtA1同源基因片段（orf-01498）并構(gòu)建了其sxtA1基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖6）。表明orf-01498基因片段與水華束絲藻屬（Aphanizomenon）、擬柱胞藻屬（Cylindrospermopsis）等藍(lán)藻進(jìn)化距離較近。暗示sxtA1基因在微小亞歷山大藻amtk-4共附生菌株Z1-D及部分藍(lán)藻之間可能存在著共同進(jìn)化［13-14］。

表2 不同生長期微小亞歷山大藻amtk-4所獲得細(xì)菌數(shù)量比較Tab．2 Comparison of number of bacterial strains isolated from A．minutum amtk-4 at different growth phases

圖4 微小亞歷山大藻amtk-4來源可培養(yǎng)細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig．4 Phylogenetic tree of 16S r RNA gene sequences of cultivable bacterial strains from A．minutum amtk-4

圖5 細(xì)菌新種Z1-D發(fā)酵產(chǎn)PSP的LC-MS分析圖譜Fig．5 LC-MSanalysis of PSP toxins from fermentation products of the novel species strain，Z1-D isolated from A．minutum amtk-4

圖6 新種Z1-D的sxtA1基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig．6 Phylogenetic tree of sxtA1 genes of strain Z1-D

3 討論

微小亞歷山大藻及鏈狀亞歷山大藻是亞歷山大藻屬兩種主要產(chǎn)PSP赤潮甲藻。前期對東海鏈狀亞歷山大藻LZ09共附生菌多樣性進(jìn)行了高通量測序分析［15］。兩種亞歷山大藻共附生菌多樣性差異比較結(jié)果顯示，微小亞歷山大藻amtk-4及鏈狀亞歷山大藻LZ09共附生菌群中變形菌比例均超過50%，為兩種藻的共附生菌絕對優(yōu)勢門，其中α-變形菌綱所占比例分別為35．6%和21．4%。兩種藻細(xì)菌群落多樣性在科及屬水平上差異較大。紅桿菌（Rhodobacteraceae）、紅螺菌 （Rhodospirillaceae）及 Alteromonadaceae在amtk-4中為優(yōu)勢科，而在LZ09中比例均低于10%。amtk-4共附生菌包括87個屬，其中以Phycisphaeraceae科未鑒定屬、Muricauda屬、腐螺旋菌科未鑒定屬、Hyphomonadaceae科未鑒定屬、Haliea屬及紅細(xì)菌科未鑒定屬為優(yōu)勢屬。而amtk-4共附生菌包括 34個屬，其中Cryomorphaceae科和Cyanobacteria科未鑒定屬、糖螺菌屬、紅細(xì)菌科未鑒定屬及Maricaulis屬為優(yōu)勢屬。兩株藻共附生菌群的共有優(yōu)勢屬為紅細(xì)菌科未知屬。本研究取得的數(shù)據(jù)可為后續(xù)開展amtk-4可培養(yǎng)共附生菌株分離策略的優(yōu)化提供科學(xué)參考。

值得關(guān)注的是，微小亞歷山大藻amtk-4及鏈狀亞歷山大藻LZ09中未鑒定屬細(xì)菌比例均高于50%，表明這兩株產(chǎn)PSP亞歷山大藻蘊(yùn)含從中發(fā)現(xiàn)功能未知微生物新種（屬）的巨大潛力。本文從微小亞歷山大藻amtk-4分離獲得的2株細(xì)菌Z1-D及Z1-4經(jīng)鑒定其分別為亞硫酸桿菌屬（Sulfitobacter）及Mesorhizobium屬新種。亞硫酸桿菌屬于變形菌門紅桿菌科（Rhodobacteraceae），現(xiàn)包括18個模式種，在海洋物質(zhì)循環(huán)中扮演重要角色。其分離來源多樣，包括海洋動植物如海星（Stellaster equestris）、海草（Zostera marina）、海水及有毒海洋硅藻［16］，而在海洋甲藻中尚未見相關(guān)報道。Mesorhizobium屬于1997年首次報道［17］，為專性共生菌，通常在豆科植物根部形成固氮固結(jié)物。該屬是繼根瘤菌之后的第二大類植物根瘤共生菌，目前包括39個模式種，但尚未在海洋甲藻中得到報道。本文所獲的新的研究結(jié)果表明，微小亞歷山大藻amtk-4蘊(yùn)含獨(dú)特的共生菌新物種資源，非常值得對其進(jìn)行進(jìn)一步深入挖掘研究。

高通量測序結(jié)果揭示了微小亞歷山大藻amtk-4具有豐富共附生菌物種多樣性信息，但通過純培養(yǎng)（culture-dependent）分離目前僅獲得數(shù)株可培養(yǎng)細(xì)菌菌株，遠(yuǎn)未體現(xiàn)出其豐富物種多樣性原貌。究其原因，絕大多數(shù)海洋微生物種群為活的不可培養(yǎng)狀態(tài)（viable but none-cultivable，VBNC），而微生物可培養(yǎng)性 （microbial cultivability）是海洋微生物研究的一個關(guān)鍵瓶頸［18］。因此，若要最大限度還原海洋復(fù)雜生態(tài)體系細(xì)菌群落生態(tài)學(xué)功能原貌，必須組合利用宏基因組學(xué)、新興單細(xì)胞基因組學(xué)（single cell genomics，SCG）等免培養(yǎng)（culture-independent）研究技術(shù)［19］，以突破傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法的局限，為解析復(fù)雜海洋特殊生境微生物菌群多樣性及其生態(tài)學(xué)功能提供研究新思路［20-21］。

海洋甲藻包括亞歷山大藻屬（Alexandrium）、裸甲藻屬（Gymnodinium）及 Pyrodinium屬等；淡水浮絲藻屬（Planktothrix）及藍(lán)藻（cyanobacteria）包 括 Cylindrospermopsis raciborskii、Anabaena circinalis、Aphanizomenon、Raphidiopsis brookii及Lyngbya wollei等均可產(chǎn)生PSP［22-24］。除上述產(chǎn)毒藻以外，存在于自然海水、藻際（phycosphere）及藻內(nèi)細(xì)菌包括如弧菌（Vibrio）、對極鞭毛菌（Alteromonas）、毗鄰單胞菌（Plesiomonas）、假單胞菌（Pseudomonas）、變形菌（Proteus）、莫拉氏菌（Moraxella）等，同樣可產(chǎn)生 PSP［25］。甲藻、藍(lán)藻及細(xì)菌產(chǎn)PSP的跨界分布（cross-kingdom）是否蘊(yùn)含某種內(nèi)在規(guī)律？而藻共附生菌群在PSP產(chǎn)生機(jī)制中究竟扮演何種角色？具有哪些潛在應(yīng)用價值？這些問題的解答目前均缺乏足夠研究數(shù)據(jù)積累，亟待系統(tǒng)發(fā)掘。藻內(nèi)共生菌在長期自然選擇進(jìn)化過程中，與甲藻形成了復(fù)雜的生態(tài)體系，構(gòu)建了復(fù)雜的化學(xué)防御系統(tǒng)［25-26］。藻共附生菌群與甲藻之間既存在多種代謝產(chǎn)物（化學(xué)防御物質(zhì)、群體感應(yīng)物質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子等）相互交流，亦有重要遺傳物質(zhì)（包括PSP合成基因）在不同物種及種屬間的基因水平轉(zhuǎn)移與融合［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，分離自微小亞歷山大藻amtk-4可產(chǎn)生STX細(xì)菌新種Z1-D的sxtA1基因與產(chǎn)毒水華束絲藻屬、擬柱胞藻屬等藍(lán)藻聚類，推測其可能存在著共同進(jìn)化［22-26］。