劉曉娉，孫新穎，劉慶慧，萬曉媛，黃 倢

（1．青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島市海水養(yǎng)殖流行病學(xué)與生物安保重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島 266071；2．上海海洋大學(xué)，上海 201306；3．濟(jì)南大學(xué)前沿交叉科學(xué)研究院，山東濟(jì)南 250022）

白斑綜合征病毒（WSSV）自20世紀(jì)90年代首次在中國臺(tái)灣地區(qū)暴發(fā)，隨后迅速傳播至東南亞、印度及南北美洲的許多國家［1-2］，給世界各地的對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失［3-5］，同時(shí)也破壞了海洋生態(tài)系統(tǒng)的平衡［6］。WSSV的宿主范圍較為廣泛，可感染40余種甲殼綱動(dòng)物以及水生浮游動(dòng)物，并表現(xiàn)出不同程度的感染性［7］，這種廣泛的宿主范圍被認(rèn)為是WSSV難以控制并大面積傳播的主要原因。

目前在Genbank上公布了7種WSSV病毒分離株的基因組全序列，包括中國的中國臺(tái)灣株（TW，AF440570，307 287bp）和中國（大陸）株（CN，AF332093，305 107bp）、（CN01，KT995472．1，309 286bp）、（CN02，KT995470．1，294 261bp）、（CN03，KT995471．1，284 148bp）、韓國的韓國株（KR，JX515788，295 884bp）以及泰國的泰國株（TH，AF369029，292 967bp）［8］。盡管總核苷酸序列同一性大于99%，但鑒定出了5個(gè)可變基因座，其由兩個(gè)具有基因組缺失的區(qū)域（ORF14／15和ORF23／24缺失區(qū)）和3個(gè)具有重復(fù)單元變化差異（VNTR）的基因座（ORF75、ORF94和ORF125）構(gòu)成［9］。目前對(duì)于WSSV分子病學(xué)的研究調(diào)查均涉及到 ORF14／15、ORF23／24的缺失情況以及ORF75、ORF94和ORF125的 VNTR數(shù)目和單核苷酸多態(tài)性的變化。PRADEEP等［10］將ORF14／15、ORF23／24這兩個(gè)變異區(qū)列為 WSSV分子流行病學(xué)、遺傳進(jìn)化追溯的首選對(duì)象?；蚪M重復(fù)區(qū)域ORF75、ORF94和ORF125的VNTR有助于研究WSSV在小地理范圍尺度上WSSV的分子流行病學(xué)的情況［11］。

本研究針對(duì)中國凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）不同養(yǎng)殖區(qū)2017年2—6月期間采集的病蝦進(jìn)行檢測。共選取42個(gè)WSSV陽性樣本進(jìn)行 ORF14／15、ORF23／24、ORF75、ORF94和ORF125共5個(gè)可變區(qū)的PCR擴(kuò)增進(jìn)行測序，分析各序列的缺失變異情況以及ORF75、ORF94、ORF125擴(kuò)增序列的重復(fù)單元數(shù)目及單核苷酸多態(tài)性的變化，以期為了解不同凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖區(qū)WSSV各毒株間的差異及分子流行病學(xué)特征提供參考資料。

1 材料與方法

1．1 樣本來源

2017年2—6月，采集來自中國河北、浙江、山東、上海、福建和廣東共6個(gè)不同省市凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖區(qū)的病蝦，保存于-80°C冰箱，樣品的采集時(shí)間、地點(diǎn)及編號(hào)見表1。

1．2 WSSV核酸提取

從保存的樣本中取約30 mg鰓組織，按照海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，離心柱型）的說明進(jìn)行 DNA提取，將提取的DNA樣本置于-20℃冷凍保存待用。

1．3 PCR檢測

對(duì) WSSV DNA樣本采用“GB／T 28630．2-2012白斑綜合征（WSD）診斷規(guī)程 第2部分套式PCR檢測法”為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測。PCR產(chǎn)物通過用1×TAE電泳緩沖液配制的1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。

1．4 PCR擴(kuò)增

將WSSV陽性樣本通過各可變區(qū)ORF14／15、ORF23／24、ORF75、ORF94和 ORF125的特定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系總量為25 μL，分別為：12．5μL PCRMix（Takara），9．5μL無菌水，1μL正向引物，1μL反向引物，1μL陽性核酸為模板。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序及引物序列見表2。

表1 凡納濱對(duì)蝦樣品采集信息Tab．1 Sampling information of Litopenaeus vannamei

表2 PCR擴(kuò)增的引物序列信息及反應(yīng)條件Tab．2 PCR primers and cycling conditions

1．5 目的基因克隆及序列比對(duì)分析

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠投影儀中將特異性條帶回收至1．5 mL離心管中，利用膠回收試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化。利用Nano Drop2000檢測膠回收產(chǎn)物的濃度，連接于pMD?18-T載體上并轉(zhuǎn)化入Top10感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，將陽性克隆進(jìn)行菌液培養(yǎng)，最后將菌液送至生工生物工程（上海）有限公司測序部。將ORF14／15序列與TH-96-Ⅱ分離株進(jìn)行比對(duì)，ORF23／24與中國臺(tái)灣株進(jìn)行比對(duì)，并分析ORF75、ORF94和ORF125重復(fù)單元數(shù)目及單核苷酸多態(tài)性的變化。

2 結(jié)果與分析

2．1 ORF14／15擴(kuò)增結(jié)果

通過對(duì)WSSV樣本的擴(kuò)增，共有28份（2#、3#、5#、7#、11#、12#、13#、14#、15#、16#、17#、18#、19#、20#、22#、23#、25#、26#、27#、28#、30#、31#、32#、33#、34#、35#、37#和 40#）樣本出現(xiàn)了ORF14／15的檢測條帶，一個(gè)泳道內(nèi)均出現(xiàn)了兩條大小不一的條帶，這可能是由樣品中DNA的斷裂或片段不完整造成的。能夠成功擴(kuò)增樣品的比率為66．67% （圖1）。

2．2 ORF23／24擴(kuò)增結(jié)果

在 ORF23／24擴(kuò)增中，有 9份（7#、9#、11#、13#、14#、27#、28#、29#、40#）樣本可以擴(kuò)增出條帶，能夠成功擴(kuò)增樣品的比例為21．43%。7#、9#、11#、13#、14#、27#、28#、29#、40#9份樣品長度均為1 265 bp（圖2）。

2．3 ORF75擴(kuò)增結(jié)果

在ORF75擴(kuò)增中，共有7份樣本檢出（7#、9#、11#、14#、27#、37#、40#），檢出率為 16．67%（圖3）。

圖1 ORF14／15的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig．1 PCR amplification electrophoresis results of ORF14／15

2．4 ORF94擴(kuò)增結(jié)果

在ORF94擴(kuò)增中，只有東營（37#）的樣本有目的條帶檢出，其余地區(qū)樣本出現(xiàn)特異性條帶，檢出率為2．38%（圖4）。

2．5 ORF125擴(kuò)增結(jié)果

在ORF125擴(kuò)增中，共有13份樣品檢出（7#、8#、9#、10#、11#、13#、14#、27#、28#、29#、36#、37#、40#），檢出率為30．95%。共出現(xiàn)4種大小不同的條帶，分別為652、633、790、859bp（圖5）。

圖2 ORF23／24的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig．2 PCR amplification electrophoresis results of ORF23／24

圖3 ORF75的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig．3 PCR amplification electrophoresis results of ORF75

圖4 ORF94的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig．4 PCR amplification electrophoresis results of ORF94

圖5 ORF125的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig．5 PCR amplification electrophoresis results of ORF125

2．6 序列比對(duì)

在ORF14／15擴(kuò)增中，共有4種大小不一的片段擴(kuò)增出來，即1 270 bp（深土鎮(zhèn)、霞美鎮(zhèn)、黃驊、臺(tái)州、海陽）、1 267 bp（深土鎮(zhèn)、霞美鎮(zhèn)、臺(tái)州）、1 850 bp（霞美鎮(zhèn)、上海）和 1 851 bp（湛江），同推測有最長序列的 TH-96-Ⅱ比對(duì)，共有4種缺失情況，即缺失 6 530、6 533、5 950、5 949 bp。

圖6 WSSV不同毒株ORF14／15擴(kuò)增區(qū)域序列比對(duì)Fig．6 Scheme of deletion region of ORF14／15 in different WSSV strains

在ORF23／24的擴(kuò)增中，只擴(kuò)增出一種長度的大小，即1 265 bp。與此區(qū)域的中國臺(tái)灣株比對(duì)，缺失了11 945 bp。

圖7 WSSV不同毒株ORF23／24區(qū)域的序列比對(duì)Fig．7 Scheme of deletion region of ORF23／24 in different WSSV strains

ORF75具有長度為102 bp和45 bp兩種類型的重復(fù)單位。其中102 bp片段的前45 bp的堿基與45 bp的重復(fù)單元序列一致。ORF75主要擴(kuò)增出3種不同大小的片段，分別為：1 739 bp（霞美鎮(zhèn)、上海）、2 019 bp（湛江）和 2 310 bp（東營）。將測得的目的片段與重復(fù)單元序列比對(duì)，結(jié)果表明45 bp的75RU數(shù)目對(duì)應(yīng)為：2、3、6，而102 bp的 75 RU數(shù)目對(duì)應(yīng)為：1、1、3，表 3為ORF75（45 bp）區(qū)域各重復(fù)單元在 12、27、80位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性。

表3 ORF75（45 bp）區(qū)域各重復(fù)單元在各位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性Tab．3 Single nucleotide polymorphisms（SNPs）at various sites in repeated units（RUs）of ORF75（45 bp）region

ORF94只擴(kuò)增出一條特異性條帶，長度為646 bp（東營）。ORF94只存在一種重復(fù)單元，大小為54 bp，其重復(fù)單元數(shù)目及單核苷酸多態(tài)性見表4。

表4 ORF94區(qū)域各重復(fù)單元在48位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性Tab．4 Single nucleotide polymorphisms（SNPs）patterns at position 48 in RUs of ORF94 region

ORF125擴(kuò)增序列大小分別為：652 bp（霞美鎮(zhèn)、湛江）、633 bp（湛江）、790 bp（濱州）和 859 bp（東營、上海）共4種。其中652 bp和633 bp的重復(fù)單元數(shù)目為4，790 bp重復(fù)單元數(shù)目為6，859 bp的重復(fù)單元數(shù)目為7。RUs為4的霞美鎮(zhèn)和湛江的樣品共出現(xiàn)6個(gè)堿基位置的突變，分別在第9、12、27、50、53、61位的堿基為 G、T、G、G、C、C。RUs為6的36號(hào)樣品共出現(xiàn)7個(gè)堿基位置的突變，第20位堿基突變?yōu)镚，它堿基突變與RUs為4的情況相同。RUs為7的37和40號(hào)樣品也是出現(xiàn)6個(gè)堿基的突變，分別在第9、12、27、50、53、61位的堿基為 G、T、G、G、C、C。表 5為ORF125擴(kuò)增序列重復(fù)單元數(shù)目及在各個(gè)位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性。

表5 ORF125區(qū)域各重復(fù)單元在各位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性Tab．5 Single nucleotide polymorphisms（SNPs）at various sites in repeated units（RUs）of ORF125 region

3 討論

白斑綜合征病毒在核苷酸序列水平上的缺失變異情況是研究其遺傳進(jìn)化差異的重要內(nèi)容，差異序列的存在可能對(duì)不同WSSV分離株的致病力產(chǎn)生影響。ORF14／15、ORF23／24、ORF75、ORF94、ORF125這5個(gè)可變區(qū)目前常被用作遺傳標(biāo)記來鑒定WSSV分離株的變異并分析其病毒擴(kuò)散模式［12-14］。在目前公布的WSSV全基因組序列中，起源于泰國株的WSSV-TH-96-Ⅱ具有最大的基因組序列，約為312kb，被假定為祖先株［15］。一般將 ORF14／15的擴(kuò)增序列與 TH-96-Ⅱ進(jìn)行比對(duì)分析，韓國株相對(duì)于TH-96-Ⅱ株缺失5 721 bp，與本研究中5 949 bp和5 950 bp大小的缺失片段相近。在 MARKS等［16］關(guān)于越南地區(qū)WSSV分離株 ORF14／15的擴(kuò)增中，17種WSSV-VN分離株中有12種有相同的6 030 bp大小的缺失。在TANG等［17］針對(duì)馬達(dá)加斯加島、莫桑比克和沙特阿拉伯地區(qū)毒株的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，ORF14／15的序列缺失片段為5 950 bp，本研究中涉及到福建霞美鎮(zhèn)和上海地區(qū)的樣本5 950 bp大小的缺失情況與其一致。另外兩種片段差異性在于1 850 bp相較于1 851 bp在第990位缺失了一個(gè)堿基A。孫新穎等［18］關(guān)于浙江、廣州、河北黃驥、山東、天津、江蘇地區(qū)的ORF14／15擴(kuò)增中出現(xiàn)6 530 bp大小的缺失片段，本研究中福建、河北、浙江和山東地區(qū)樣本的缺失情況與其一致。本研究中ORF14／15的缺失情況均為大片段的缺失，且缺失片段大小差異不明顯，推測ORF14／15的變異是為了感染其它宿主物種的適應(yīng)策略。

在本研究中ORF23／24擴(kuò)增序列的缺失片段大小均為11 945 bp，除去缺失部分序列與CN株100%相同。DIEU等［19］在越南中部和南部地區(qū)WSSV分離株的 ORF23／24擴(kuò)增中顯示出8 539～12 166 bp的缺失。在我國2014年河北、遼寧、江蘇、浙江、廣東地區(qū)的研究樣本擴(kuò)增中缺失片段大小為 12 064 bp［18］，2015年山東、浙江、天津、海南地區(qū)缺失片段大小為12 070 bp［20］。綜合以上結(jié)果表明，ORF23／24的擴(kuò)增受地理環(huán)境的影響不大，而且缺失大小差異也不明顯，均為大片段的缺失，推測較大片段的缺失會(huì)給WSSV帶來復(fù)制優(yōu)勢和對(duì)外部環(huán)境適應(yīng)性的增加。

本研究中ORF75的總RUs數(shù)目為3、4、9共3種類型，其中45 bp的數(shù)目為2、3、6，102 bp的數(shù)目為 1、1、3。DURAN-AVELAR等［21］發(fā)現(xiàn)，ORF75的RUs數(shù)目介于5～20之間，DIEU等［22］在越南發(fā)現(xiàn)了7RUs的單倍型，其中包括6個(gè)45 bp的RUs及1個(gè)102 bp的 RU。在2015年山東、天津、浙江地區(qū)的研究樣本中總ORF75的RUs數(shù)目為 2、3、4［20］，陳紅蓮等［23］在 2016年安徽合肥、六安、滁州的樣本中檢測出3、6、9、10和11共 5種 RUs。相較于國外，國內(nèi)部分地區(qū)ORF75 RUs出現(xiàn)了2和3兩種較小的RUs。

ORF 94的RU為54 bp，本實(shí)驗(yàn)僅擴(kuò)增出一個(gè)樣本。WONGTEERASUPAYA等［24］在研究2000—2002年間泰國地區(qū) WSSV樣品時(shí)顯示ORF94的RUs差異很大，范圍從6～20 RU。目前在國內(nèi)外的研究報(bào)道中其RUs數(shù)目介于2～20之間，其中 6RUs為常見基因型［25］，與37號(hào)（東營）樣品的RUs數(shù)目一致。除此之外，其重復(fù)單元會(huì)在第48位出現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性。分析37號(hào)樣本序列，發(fā)現(xiàn)其在48位的堿基為 T、T、T、T、G、G，與 SINDHUPRIYA等［26］在 ORF94擴(kuò)增中 SNP的研究結(jié)果一致。表現(xiàn)出了單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)低頻率的變異情況。

相對(duì)于 ORF75和 ORF94的檢出情況，ORF125的檢出率相對(duì)較高，為30．95%，其RUs數(shù)目分別為4、6、7。其中6RUs和7RUs兩種基因型常分布于越南［27-29］，同時(shí)在2016年安徽省的六安、合肥、蕪湖、滁州以及池州的樣本中也出現(xiàn)了相同的兩種重復(fù)單元數(shù)目［23］。而在2015年山東、天津、浙江、海南地區(qū)以及2016年日照、唐山、黃驊、滄州、秦皇島、寧波地區(qū)ORF125的RUs分別為 3、5、6和 4、5、6［20，30］，本實(shí)驗(yàn) VNTRs的研究結(jié)果與其差異較大。研究結(jié)果表明，ORF125的VNTRs在不同年份受地域環(huán)境及地區(qū)的影響相對(duì)較小，出現(xiàn)較多的交叉情況，有一定的規(guī)律可循。除此之外，福建霞美鎮(zhèn)及廣東湛江的樣品與以往研究相同，均在 9、12、27、50、53、61位點(diǎn)出現(xiàn)了堿基突變［20］，表現(xiàn)出ORF125的SNP均一性及穩(wěn)定性。

本研究通過對(duì)2017年樣品的擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，相較于2014—2015年的研究結(jié)果，ORF14／15的缺失程度有所增大，而ORF23／24的缺失片段大小差異并不明顯，表現(xiàn)出不同地區(qū)及年份的穩(wěn)定性。ORF75、ORF94、ORF125的 RUs及 SNP表現(xiàn)出高度多態(tài)性的同時(shí)并有一定規(guī)律可循。據(jù)此推測較大程度的缺失以及重復(fù)單元數(shù)目的變化可能受環(huán)境選擇壓力的影響，更有利于病毒的復(fù)制及傳播，而其對(duì)WSSV的毒力大小是否產(chǎn)生影響還需要進(jìn)一步的探究。