周清,舒憲,王鈺婷,李明浩,湯才國,倪軍,趙薇薇,黃勝威,*,吳麗芳,*

1.中科院強磁場與離子束物理生物學重點實驗室,國家林業(yè)局能源林研究中心,合肥 230031

2.中國科學技術大學,合肥 230026

3.安徽省環(huán)境毒理與污染控制技術安徽省重點實驗室,合肥 230031

4.安徽省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑研究所,合肥 230001

0 前言

小麥赤霉病(Fusariumhead blight,FHB)主要由禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)引起,是我國小麥生產(chǎn)中的主要病害,也是世界性的小麥種植病害之一[1]。該病多發(fā)生在潮濕和溫暖地區(qū),給小麥產(chǎn)量造成嚴重損失的同時,還可以產(chǎn)生以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON,嘔吐毒素)為主的多種真菌毒素,嚴重危害人類和家畜的健康[2]。長期以來,我國小麥赤霉病的發(fā)生主要集中在長江中下游、華南麥區(qū)及東北春麥區(qū)。但近些年來,隨著氣候變化和耕作制度的改變,小麥赤霉病的發(fā)生區(qū)域也逐漸擴大,逐漸向北擴展蔓延。目前已成為制約我國小麥生產(chǎn)的一種重要病害,且呈逐年加重趨勢,成為我國農(nóng)業(yè)科技工作者高度關注的一類病害[3]。

對于小麥赤霉病的防治,現(xiàn)階段仍然主要依靠化學農(nóng)藥。以多菌靈及其復配劑為主[3],其他制劑,如70%甲基硫菌靈WP[4]以及30%多·酮WP[5]等新型藥劑用于防治小麥赤霉病也有報道。然而,長期使用化學殺菌劑,已經(jīng)引起一系列問題,如農(nóng)藥殘留,環(huán)境污染和導致病原菌抗藥性增加[2-3]。由于目前尚無高抗赤霉病的小麥品種出現(xiàn),因此生物防治成為化學防治之外防控小麥赤霉病的最佳選擇,有著廣泛的實踐意義。目前,國內(nèi)外赤霉病拮抗微生物的研究主要集中在芽孢桿菌和鏈霉菌等少數(shù)幾種類群的細菌,如枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis[6,7],解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens[8,9],多黏類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa[10],馬來西亞鏈霉菌Streptomyces malaysiensis[11]等。關于其他生防微生物的研究相對較少,這也在一定程度上限制了拮抗微生物在小麥赤霉病防控方面的應用。

本文報道了從麥田土壤中分離到的一株對小麥赤霉病病菌有較強抑制效果的拮抗細菌-奇異變形桿菌Proteus mirabilis,并研究了該菌株對禾谷鐮刀菌菌絲生長,孢子萌發(fā)的抑制以及在田間對赤霉病的拮抗效果,以期為小麥赤霉病的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試病原菌禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearumSchw.)由本室分離保存。

PDA 培養(yǎng)基用于禾谷鐮刀菌培養(yǎng)及拮抗菌對峙培養(yǎng);NA 液體培養(yǎng)基、NB 固體培養(yǎng)基用于拮抗細菌培養(yǎng)觀察。CMC 培養(yǎng)基(CMC 15 g·L-1,NH4NO3·7H2O 0.5 g·L-1,酵母提取物1 g·L-1,H2O 1000 mL)用于分生孢子培養(yǎng)。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥赤霉病拮抗菌的分離與篩選

自小麥赤霉病發(fā)病田塊采集表層土壤(10—15 cm處土壤)。過2 mm 不銹鋼篩后,稱取10 g 土壤樣品,放入盛有90 mL 無菌水的三角瓶(底部盛有滅菌玻璃珠),200 rpm 震蕩1 h,制成土壤懸液。吸取1 mL土壤懸液,采用滅菌水梯度稀釋101—109倍。隨后,分別吸取各稀釋度土懸液0.1 mL,均勻涂布于NB固體培養(yǎng)基平板上,28 ℃恒溫培養(yǎng)2—3 d。待菌落長出后,挑取不同形態(tài)的單菌落至NB 固體培養(yǎng)基平板上,劃線培養(yǎng),連續(xù)劃線3—4 次,4 ℃保存待用。

拮抗細菌篩選采用平板對峙法[2]進行。將禾谷鐮刀菌(指示菌)在PDA平板上活化,采用直徑5 mm 的打孔器在菌落邊緣制備菌餅,接種于空白PDA 平板中央,同時在其周圍距中央25 mm 位置接種待測細菌菌株。每皿接種4 種待測細菌菌株,每個處理3 次重復。以單接禾谷鐮刀菌為對照,28℃恒溫培養(yǎng),待對照禾谷鐮刀菌充滿培養(yǎng)皿后測量菌落直徑,計算抑菌率。

抑菌率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100。

選取抑菌率最高的細菌菌株,用于隨后的進一步研究。

1.2.2 小麥赤霉病拮抗菌的鑒定

生理生化鑒定:參照《常見細菌鑒定手冊》[12],對拮抗細菌進行革蘭氏染色、運動性觀察、接觸酶反應、氧化酶反應、甲基紅試驗反應、吲哚反應、糖類發(fā)酵試驗、酪氨酸水解試驗、利用檸檬酸鹽試驗、丙二酸鹽利用試驗等生理生化指標測定。

分子生物學鑒定:拮抗菌株在NA 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,用EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit(北京全式金生物技術有限公司,北京,中國)提取基因組DNA,用27F和1492R引物擴增16S rRNA基因片段。PCR 產(chǎn)物連接至pEASY-T1 載體,陽性克隆子送交生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。菌株16S rDNA 序列與NCBI(國家生物技術信息中心,www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中的已發(fā)表序列進行比對[13],并采用Mega 7.0 軟件中的最大似然法分析分離拮抗菌株的16S rRNA 基因與相似種屬的進化關系,Bootstrap 值設為1000[14]。同時,將菌株16S rDNA 序列提交到GenBank 數(shù)據(jù)庫。

1.2.3 拮抗細菌對赤霉菌孢子萌發(fā),菌絲生長及DON 產(chǎn)生的抑制

1) 孢子萌發(fā)抑制效果研究

采用 CMC 培養(yǎng)基培養(yǎng)禾谷鐮刀菌(F.graminearumSchw.),獲得孢子懸浮液。5000 rpm 離心3 min,收集孢子,然后分別加入拮抗細菌1 mL培養(yǎng)液、拮抗細菌無細胞上清液和拮抗細菌細胞內(nèi)含物。接種1 mL 空白NB 培養(yǎng)基的處理作為對照。所有處理在25°C 下孵育72 h,檢查計算孢子的發(fā)芽率。每個處理三次重復。

2) 菌絲生長抑制效果研究

將10 mL 空白NB 培養(yǎng)基、10 mL 無細胞上清、以及10 mL 拮抗細菌細胞內(nèi)含物分別與90 mL 的PDA 混合,混勻后倒平板。采用直徑5 mm 的打孔器在活化的禾谷鐮刀菌(F.graminearumSchw.)菌落邊緣打取菌餅,將直徑5 mm 的菌絲體接種于培養(yǎng)皿的中央,28 ℃下培養(yǎng)5 天,然后測量禾谷鐮刀菌菌落直徑。采用下列公式計算抑制率:

抑制率(%)=(C-E)/C×100%,其中C為對照菌落直徑,E為處理菌落的直徑。

3) DON 產(chǎn)生抑制效果研究

選取10 g 健康干燥的小麥籽粒,裝入250 mL 錐形瓶中,滅菌。處理組加入3 mL 拮抗細菌無細胞上清或3 mL拮抗細菌新鮮培養(yǎng)液,對照組加入3 mL空白NB 培養(yǎng)基。處理組和對照組均加入1 mL 禾谷鐮刀菌(F.graminearumSchw.)分生孢子懸浮液(1×105CFU·mL-1),置于28℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)20 天后,取出處理組和對照組小麥籽粒,液氮研磨,加入25 mL 84%的甲醇水溶液并劇烈震蕩2 小時,12000 rpm 離心10 分鐘,收集上清液。沉淀采用甲醇水溶液重新提取,合并兩次上清液,0.22 μm 過濾器過濾。濾液采用高效液相色譜法(HPLC)檢測DON 含量。色譜柱為Kromasil C18 色譜柱,流動相為80%甲醇水溶液,流速1 mL·min-1,檢測波長218 nm,以峰面積計算抑制率。

1.2.4 拮抗細菌防治赤霉病田間試驗

田間試驗于2017年在中國安徽省合肥市蜀山區(qū)中國科學院合肥物質(zhì)科學研究院技術生物與農(nóng)業(yè)工程研究所試驗田進行。試驗小區(qū)面積6 m2(2×3 m),每個處理3 個重復,小區(qū)采用隨機區(qū)組設計。

拮抗菌對溫室中麥苗赤霉病防治效果測定參考王瑤等[14]方法進行。采用 PBS 緩沖液,制備F.graminearum分生孢子懸浮液和拮抗菌株DY05 菌懸液。在小麥揚花期,采用空氣噴霧器,將200 mLF.graminearum分生孢子懸浮液(5×105CFU·mL-1)均勻噴施于小麥穗中間的小花中。處理組隨后用200 mL 濃度為108CFU·mL-1的菌株DY05菌懸液噴灑小麥穗中間的小花中,對照組噴以200 mL 新鮮PBS 緩沖液。接種后,用塑料薄膜覆蓋,72 h 后去掉塑料薄膜。處理21 天后,調(diào)查所有試驗小區(qū)小麥,每小區(qū)選取300 個麥穗,統(tǒng)計發(fā)病嚴重度,計算FHB疾病發(fā)病率。其中,發(fā)病率=發(fā)病麥穗數(shù)/總麥穗數(shù),發(fā)病程度=小麥病粒數(shù)/小麥總粒數(shù),病情指數(shù)=發(fā)病率×發(fā)病程度/100。

1.2.5 拮抗細菌促生長特性試驗

1) 室內(nèi)實驗

在28℃條件下,測定拮抗菌株的植物促生長能力,包括溶磷能力,產(chǎn)鐵載體、產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)、氫氰酸(HCN)和ACC 脫氨酶活性。溶磷能力測定采用NBRIP 培養(yǎng)基,參照Rodrigues 等[16]方法測定。 鐵載體測定采用CAS 檢測法[17],初步測定菌株合成鐵載體的能力。溶液顏色變黃,表明有鐵載體生成。生長激素IAA 測定參照Glickmann 和 Dessaux[18]介紹的方法,測定菌株分泌IAA 的能力。ACC 脫氨酶活性和HCN 產(chǎn)生能力測定參照文獻[19]測定。

2) 盆栽實驗

將健康飽滿的小麥種子表面消毒(70%乙醇浸泡1 min,1%次氯酸鈉浸泡5 min),然后用滅菌蒸餾水洗滌5 次。消毒后的種子轉(zhuǎn)移至無菌燒杯中,用紗布保濕保溫,放入37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 d(注意補充水分,保持濕潤)。種子露白后,挑選長勢均一的小麥種子,進行下一步試驗。

處理組選取30 粒萌發(fā)的小麥種子,用100 mL 濃度為108CFU·mL-1的拮抗菌株新鮮培養(yǎng)液浸泡24 h,對照組選取30 粒清洗過的小麥種子,采用100 mL新鮮空白NB 培養(yǎng)基浸泡24 h。隨后,將對照組和處理組小麥種子栽培于花盆中(花盆規(guī)格:上口徑17 cm,下口徑11.7 cm,盆高14 cm,每盆裝500 g 營養(yǎng)土,170 g 珍珠巖,100 mL 水),每盆6 粒,注意補足水分。在25 ℃的溫室中,16:8 的晝夜光周期下培養(yǎng)30 d 后,測定小麥根長和株高,濕重,隨后將小麥根、莖105 ℃殺菌30 min,于80 ℃烘干至恒重,稱量干重。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復3 次,采用SPSS 17.0 對數(shù)據(jù)進行分析處理,并用單因素方差分析的LSD 法進行顯著性分析(P＜ 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細菌分離及鑒定

從田間采集的樣品中共分離純化出35 株細菌。將這35 株菌株分別接種到PDA 培養(yǎng)基上,同禾谷鐮刀菌進行對峙試驗。其中,菌株DY05 對禾谷鐮刀菌具有明顯拮抗作用(圖1),靠近菌株DY05 菌落的禾谷鐮刀菌菌絲體生長受到抑制,不能正常外延生長,出現(xiàn)明顯的抑菌帶。選取該菌株進行后續(xù)研究。

參照《常見細菌鑒定手冊》,對拮抗菌株DY05進行生理生化鑒定,測定結(jié)果如表1所示。

為進一步確定菌株的分類地位,將擴增出的16S rDNA 片段測序。擴增片段序列長度為1504 bp,相應的序列提交至GenBank (登陸號MH050359) 。以16S rDNA 序列同源性為基礎構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果顯示,DY05 與奇異變形桿菌Proteus mirabilis聚在同一分支,序列同源性高達99%。結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果,菌株DY05 被鑒定為奇異變形桿菌P.mirabilisDY05。

2.2 拮抗細菌對禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā),菌絲生長及DON 產(chǎn)生的抑制

圖1 拮抗株菌DY05 對禾谷鐮刀菌的拮抗作用 Figure1 Antifungal activities of DY05 against F.graminearum in plate tests

表1 菌株DY05 部分生理生化試驗結(jié)果 Table1 Physiological and biochemical characteristic of the bacterial isolate DY05

圖2 基于菌株DY05 16S rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育分析 Figure2 Phylogenetic tree of the strain DY05 based on 16S rDNA sequences

拮抗細菌P.mirabilisDY05 對禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā),菌絲生長及DON 產(chǎn)生的抑制效果如表2所示。其中,P.mirabilisDY05 菌株培養(yǎng)液和無細胞上清液對禾谷鐮刀菌的孢子萌發(fā)的抑制效果均達到100%,對菌絲生長抑制率也分別達到79.50%和 51.25%,表現(xiàn)出良好的生防潛力。與此同時,DY05 菌株細胞內(nèi)含物對孢子萌發(fā)和菌絲生長的抑制效果相對較差,分別為19.7%和8.75%,表明該菌株起拮抗效果的物質(zhì)主要存在于上清中而不是存在于胞內(nèi)。

此外,DON 產(chǎn)生抑制試驗結(jié)果表明,DY05 菌株培養(yǎng)上清液處理可以顯著減少DON的產(chǎn)生,與對照組相比,DON 含量減少了82.82%。

2.3 拮抗細菌對麥苗赤霉病防治效果測定

由表3可知,菌株DY05發(fā)酵液處理可以顯著降低赤霉病發(fā)病率和嚴重度。拮抗菌株DY05 處理后,小麥赤霉病的發(fā)病率為11.68%,與對照組的發(fā)病率24.40%相比,發(fā)病率降低了52.13% (p＜0.05)。同時,菌株DY05 處理組小麥赤霉病病情指數(shù)與對照組相比,也降低了48.74%,差異顯著。表明拮抗細菌DY05 發(fā)酵液原液對小麥赤霉病有較好的防治效果,能增強小麥的赤霉病抗性。

表2 菌株DY05 對禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)和菌絲生長的抑制作用 Table2 Inhibition activity of culture supernatant,cell lysate and cells of strain DY05 on spore germination of F.graminearum

2.4 拮抗菌株促生長特性

菌株DY05 的促生長特性如圖3所示。由圖3可以看到,該菌株不能產(chǎn)生HCN,但是可以產(chǎn)生鐵載體和IAA,并具有溶磷作用和ACC 脫氨酶活性,說明該菌株具有很好的促生長潛力。

盆栽試驗結(jié)果顯示,菌株DY05 對小麥植株生長具有顯著的促進作用(表4)。與對照組相比,菌株DY05 處理可以顯著提高小麥幼苗莖高、根長、鮮重和干重,其中莖高、根長、鮮重和干重分別提高了22.21%、26.41%、44.77%和26.53%。

表3 菌株DY05 對小麥赤霉病田間防治效果 Table3 Efficacy of DY05 on Fusarium head blight on winter wheat in field trial

圖3 拮抗菌株DY05 的促生長特性(A：產(chǎn)鐵載體能力試驗;B：產(chǎn)IAA 能力試驗;C：產(chǎn)HCN 能力試驗;D：溶磷能力試驗;E：ACC 脫氨酶活性試驗) Figure3 Characterization of plant growth-promoting traits strain DY05 (A：siderophore synthesis test;B：test of IAA production ability;C：HCN capacity;D：phosphate solubilizing;E：ACC deaminase activity).

表4 盆栽試驗中菌株DY05 對小麥幼苗生長的促進作用 Table4 Growth promotion effects of strain DY05 on wheat seedlings in pots

3 討論

近年來,國內(nèi)外研究者在小麥赤霉病拮抗菌分離鑒定及抗病特性研究等方面做了大量的工作,從各種生態(tài)環(huán)境中分離得到多株對禾谷鐮刀菌等病原真菌具有拮抗作用的菌株。已獲得的拮抗菌株中,以細菌居多,而研究最多的為芽孢桿菌和放線菌[15],如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)[20],微白黃鏈霉菌(Streptomyces albidoflavus)[21]。關于其他類群細菌對禾谷鐮刀菌的拮抗作用的相關研究相對較少,有待進一步去發(fā)掘利用。本研究從土壤中分離出一株對禾谷鐮刀菌具有拮抗作用的細菌,經(jīng)鑒定屬于奇異變形桿菌Proteus mirabilisDY05。奇異變形桿菌屬于革蘭陰性菌,沒有莢膜和芽孢,有鞭毛和菌毛的,在自然界、動物糞便以及人和動物的腸道內(nèi)廣泛存在。目前,尚無該菌拮抗禾谷鐮刀菌的報道。

孢子和菌絲生長抑制試驗結(jié)果表明,拮抗菌株DY05 可明顯抑制禾谷鐮刀菌菌絲體生長和分生孢子萌發(fā)。陳亮等[9]研究發(fā)現(xiàn),解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)可顯著抑制禾谷鐮刀菌菌絲體生長和分生孢子萌發(fā),引起菌絲體畸形、細胞膜損傷。劉偉成等[22]研究了8 株芽孢桿菌對禾谷鐮刀菌的拮抗作用,發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌對病原菌分生孢子萌發(fā)抑制機理主要為抑制孢子萌發(fā)和芽管伸長,以及誘使分生孢子芽管頂端細胞膨大呈球狀,失去生長能力。本研究中,拮抗菌株DY05 對禾谷鐮刀菌的抑制作用,是否也是通過損傷禾谷鐮刀菌細胞膜和孢子膜,從而導致菌絲體生長畸形,分生孢子萌發(fā)受到抑制,還有待進一步研究。同時,研究還發(fā)現(xiàn),拮抗菌株DY05 產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)存在于發(fā)酵液中,其無細胞上清對禾谷鐮刀菌有較強拮抗作用。宗英等[20]研究表明,貝萊斯芽孢桿菌JS25R 發(fā)酵液對禾谷鐮刀菌菌絲生長和孢子萌發(fā)具有很好的抑制作用,推測起作用的活性物質(zhì)可能為抗菌蛋白。李峰等[23]研究發(fā)現(xiàn),多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)的無菌發(fā)酵濾液對禾谷鐮刀菌菌絲生長有明顯抑制作用,導致菌絲生長發(fā)生畸形,出現(xiàn)原生質(zhì)體凝集、菌絲斷裂和細胞壁瓦解現(xiàn)象,且推測該菌產(chǎn)生的拮抗化合物可能是蛋白類或肽類物質(zhì)。藺國強等[24]研究發(fā)現(xiàn),解淀粉芽孢桿菌X-42 發(fā)酵液中的脂肽類物質(zhì),能直接破壞禾谷鐮刀菌菌絲結(jié)構(gòu),也能影響分生孢子萌發(fā),導致菌絲及孢子局部膨大。拮抗菌株DY05 產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)是脂肽類物質(zhì),或者為抗菌蛋白,還有待進一步深入研究。

生物防治的關鍵是在田間條件下發(fā)揮作用,室內(nèi)拮抗效果良好的菌株,受田間環(huán)境條件影響,其拮抗效果有可能會降低,因此,需要系統(tǒng)化進行田間試驗,以驗證菌株的實際生防效果。田間小麥赤霉病防治試驗結(jié)果顯示,DY05 在田間接種小麥赤霉菌孢子后施用,可以有效控制小麥赤霉病,為在小麥生產(chǎn)上應用DY05 防控赤霉病提供了理論依據(jù)。藺國強等[24]應用解淀粉芽孢桿菌X-42 防治小麥赤霉病,發(fā)現(xiàn)接種小麥赤霉菌孢子前或接種后施用X-42,均可以有效控制小麥赤霉病發(fā)生,顯示了良好的應用潛力。近些年來,小麥赤霉病已經(jīng)成為我國長江中下游冬麥區(qū)和東北部春麥區(qū)最嚴重的流行病害之一[2]。噴施多菌靈,一直是生產(chǎn)上防治小麥赤霉病的主要措施。然而,越來越多的研究結(jié)果顯示,多菌靈等化學農(nóng)藥可以誘導病原菌產(chǎn)生抗藥性,并且能夠促進DON 毒素的合成,導致我國赤霉病的狀況愈發(fā)嚴重和廣泛[25]。因此,開發(fā)環(huán)境友好,替代多菌靈的防控措施,已經(jīng)成為擺在小麥赤霉病防控工作者面前一個亟待解決的難題。本研究篩選得到的拮抗菌株DY05,在室內(nèi)菌絲生長抑制試驗和田間小麥赤霉病防治試驗中均表現(xiàn)出良好的防治效果,為進一步開發(fā)生物防控赤霉病菌劑提供了優(yōu)良材料。

目前,關于禾谷鐮刀菌拮抗細菌的研究,多集中在菌株分離鑒定,拮抗效應評價及活性組分分離純化等方面,關于拮抗細菌的促生長效果研究較少。已有的研究結(jié)果顯示,植物生長促進細菌(PGPB)或植物生長促進的根際細菌(PGPR),可以刺激植物生長,增加產(chǎn)量,減少病原體感染以及生物或非生物植物脅迫[26]。與促進植物生長相關的性質(zhì)包括:IAA 和鐵載體的產(chǎn)生,固氮,植物病原拮抗作用,氰化作用,磷酸鹽的溶解以及氨基環(huán)丙烷-1-羧酸酯(ACC)脫氨酶活性的產(chǎn)生。促生長特性試驗表明,拮抗菌株DY05 可以產(chǎn)生鐵載體和IAA,并具有溶磷作用和ACC 脫氨酶活性,表明該菌株具有很好的促生長潛力。盆栽實驗也顯示,小麥的莖高、根長、鮮重和干重有明顯的上升。這些研究結(jié)果表明,拮抗菌株DY05 具有拮抗病原真菌和促進植物生長的雙重功能,從而能夠在控制植物病害發(fā)生的同時,增加產(chǎn)量,具有開發(fā)成商業(yè)生物防治制劑運用于小麥生產(chǎn)的潛力。