秦 燕，趙永康，周華安2，郭泓鋆2，楊 洪，李 蘭

(1.成都市農林科學院，四川 成都 611130； 2.四川天宇種業(yè)有限責任公司，四川 成都 610101)

單倍體自然發(fā)生機率極低，一般不超過0.01%[1]，要獲得大量的單倍體必須依靠人工誘導。1929年首次發(fā)現玉米單倍體[2]，1950年發(fā)現玉米單倍體誘導系Stock 6材料，使玉米單倍體育種技術由設想變?yōu)楝F實[3]。采用常規(guī)育種方法選育品種，周期長，效率低，財力物力人力花費很大。通過誘導獲得單倍體，進行單倍體染色體加倍，只需2個世代就可以獲得純系(DH系)，縮短了自交系選育年限，加速了品種改良的進程[4]。單倍體育種技術在普通玉米育種中得到廣泛應用[5-7]，也正逐漸應用于糯玉米育種中[8-11]，大大提高了糯玉米雜交組合的配制效率，縮短了優(yōu)良糯玉米雜交種的選育年限。因此，本研究以2個糯玉米地方品種群體、2個人工合成糯玉米群體和2個糯玉米單交種為基礎材料，利用單倍體誘導系進行雜交誘導、單倍體鑒定和染色體化學加倍，探討單倍體技術在糯玉米育種中應用，加快糯玉米育種進程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為四川農業(yè)大學引進的改良誘導系YD 1、YD 2、YD 3，3個誘導系均具有籽粒Navajo標記。6份誘導基礎材料分別為從長江師范大學引進的糯玉米地方品種N 1、N 2及成都市農林科學院合成的糯玉米群體N 3、N 4及糯玉米雜交種N 5(蘇玉糯202)、N 6(京科糯2000) (表1)。

1.2 試驗方法

2016年春季在崇州羊馬科技試驗園區(qū)進行6個誘導基礎材料的單倍體誘導雜交，每個基礎材料種植300株，3個父本誘導系分期播種，使其父母本花期相遇。每個群體材料與誘導系各做20個雜交果穗，對得到的雜交果穗進行單穗單粒鑒定。

1.3 單倍體鑒定

在雜交果穗上逐粒鑒別: 紫色粒頂、無色胚芽尖的籽粒為擬單倍體，紫頂紫胚及無色粒頂、紫色胚芽尖的籽粒為非單倍體。在苗期依據植株生長勢、株型以及紫色植株標記進一步鑒定，植株生長勢強、植株高大、葉片寬大株型披散、莖干或葉片出現紫色的植株均為雜合植株，全部去除，保留生長發(fā)育慢、植株較矮、葉片上沖、葉色較淺的單倍體植株。

統(tǒng)計雜交籽粒數、擬單倍體籽粒數、出苗數、去除雜株數后，計算擬單倍體誘導率、標記鑒定準確率、校正單倍體誘導率。在計算標記鑒定準確率時，假設沒出苗的均為單倍體籽粒，因為單倍體籽粒的生長勢弱。

擬單倍體誘導率(%)=(擬單倍體籽粒數/雜交籽粒數)×100%；

標記鑒定準確率(%)=[(擬單倍體籽粒數-去除雜株數)/擬單倍體籽粒數]×100%；

表1 供試材料來源

供試材料系譜來源YD1(GY-1×ZY-1)×ZY-1BC3F1-4四川農業(yè)大學YD2(ZY-1×STOCK6)×ZY-1BC2F2-19四川農業(yè)大學YD3二倍體雜株×ZY-1F5-8四川農業(yè)大學N1重慶石柱白糯(地方品種)長江師范大學N2重慶秀山白糯(地方品種)長江師范大學N3白糯人工合成群體1成都市農林科學院N4黃糯人工合成群體2成都市農林科學院N5蘇玉糯202白糯(N0201×N006)江蘇南通志飛玉米研究所N6京科糯2000白糯(京糯6×BN2)北京農林科學院玉米研究中心

表2 糯玉米單倍體籽粒鑒定及田間鑒定結果

單倍體材料雜交籽粒數擬單倍體粒數擬單倍體率/%出苗株雜合株數出苗率/%標記鑒定準確率/%校正單倍誘導率/%N1×YD11356876.4681578.282.85.0N1×YD220141095.4861378.988.14.3N1×YD31546684.4561282.482.43.6N2×YD124091586.61262679.783.55.2N2×YD21398835.9561267.585.54.0N2×YD31876764.1651285.584.23.5N3×YD120051567.81341885.988.56.7N3×YD225121977.81483675.181.75.9N3×YD327131485.51122675.782.44.1N4×YD116431026.2742872.572.54.5N4×YD217031589.31023364.679.16.0N4×YD315471026.6742172.579.44.8N5×YD11679965.7771580.284.44.6N5×YD221631054.9722468.677.13.3N5×YD31835673.7481071.685.12.6N6×YD120791135.4772868.175.23.7N6×YD21834955.2741477.985.34.0N6×YD320131015.0682167.379.23.4

校正單倍體誘導率(%)=[(擬單倍體籽粒數-去除雜株數)/雜交籽粒數]×100%；

出苗率(%)=(出苗數/擬單倍體籽粒數)×100%。

1.4 染色體人工加倍

待擬單倍體植株長到6～7葉1心時，利用0.2 mL的0.06%秋水仙素+2%二甲基亞砜對單倍體植株進行注射加倍處理，待到散粉吐絲期進行單株掛牌和套袋自交。

統(tǒng)計化學加倍株數、散粉株數、結實株數，計算散粉株率、結實株率。

散粉株率(%)=(散粉株數/化學加倍株數)×100%；

結實株率(%)=(結實株數/化學加倍株數)×100%。

1.5 統(tǒng)計分析

數據統(tǒng)計采用Excel軟件和DPS 7.05軟件進行。

2 結果與分析

2.1 糯玉米單倍體籽粒鑒定及田間鑒定

以引進的誘導系YD 1、YD 2、YD 3為父本，糯玉米基礎材料N 1～N 6做母本，籽粒鑒定結果見表2。從表2可知，糯玉米材料的雜交誘導籽粒數為1 356～2 713粒，平均數為1 906.9粒，獲得的擬單倍體籽粒為67～197粒，平均數為112.3粒，擬單倍體率的變化幅度為3.7%～9.3%，變化幅度較大，平均擬單倍體率為5.9%。

將擬單倍體籽粒進行田間鑒定(表2)。從表2可知，糯玉米材料單倍體籽粒的出苗率為67.4%～85.9%，平均出苗率為75.0%，表明單倍體籽粒由于生長勢較弱不能全部出苗，在實際應用中可適當加大基礎材料與誘導系的雜交穗數。

從雜合株數及標記鑒定準確率來看，糯玉米材料的擬單倍體中均含有雜株，標記鑒定準確率為72.5%～85.5%，平均數為81.6%，表明由于不同基礎材料遺傳背景影響Navajo標記的表達，進而影響標記鑒定的準確度。糯玉米材料經過校正后的單倍體誘導率為2.6%～6.7%，平均誘導率為4.3%，變化幅度較大。

表4 各性狀方差分析表

變異來源自由度出苗率/%標記鑒定準確率/%擬單倍體率/%校正單倍體誘導率/%散粉株率/%結實株率/%誘導系21.500.096.05?6.17?2.551.04基礎材料51.461.584.37?4.46?4.62?5.80?誤差100.00340.00150.00010.000050.00020.0001

注：“*”表示在0.05水平上顯著。

2.2 糯玉米單倍體籽?；瘜W加倍分析

用秋水仙素對單倍體植株進行化學加倍處理，結果見表3?；瘜W加倍后單倍體的散粉株率幅度為7.4%～15.5%，平均散粉株率為11.4%，化學加倍后單倍體的結實率幅度為2.6%～7.1%，平均結實率為5.1%，散粉株率和結實率的變化幅度均較大。

表3糯玉米單倍體化學加倍結果

單倍體材料化學加倍株數散粉株數結實株數散粉株率/%結實株率/%N1×YD1688411.85.9N1×YD28413515.56.0N1×YD3568314.35.4N2×YD11261269.54.8N2×YD2567412.57.1N2×YD36510415.46.2N3×YD113416711.95.2N3×YD214818812.25.4N3×YD3112958.04.5N4×YD1749512.26.8N4×YD210212611.85.9N4×YD3748410.85.4N5×YD1778310.43.9N5×YD272739.74.2N5×YD3486212.54.2N6×YD1778210.42.6N6×YD274739.54.1N6×YD368537.44.4

2.3 不同基礎材料各性狀差異顯著性分析

將各基礎材料與3個誘導系雜交所得單倍體的出苗率、標記鑒定準確率、擬單倍體率、校正單倍體誘導率、散粉株率、結實株率進行方差分析，結果見表4。由表4可知，出苗率、標記鑒定準確率在誘導系間和基礎材料間的差異均不顯著，而擬單倍體率、校正單倍體誘導率在誘導系間和基礎材料間差異均達顯著水平，基礎材料間散粉株率、結實率差異也達顯著水平。結果表明，單倍體誘導率受母本基礎材料和父本誘導系影響均較大，而散粉株率、結實株率則主要受母本基礎材料影響。

對差異達顯著水平的性狀按材料計算均數并做多重比較，結果見表5。從基礎來料的擬單倍體率、校正單倍體誘導率來看，人工合成群體N 3、N 4的均值最高，高于地方品種N 1、N 2，顯著高于單交種N 5、N 6。從基礎材料的散粉株率和結實株率來看，地方品種N 1、N 2的均值較高，高于或等于人工合成群體N 3、N 4，顯著高于單交種N 5、N 6。

從誘導系的擬單倍體率、校正單倍體誘導率來看，YD 2最高，顯著高于YD 1和YD 3。誘導系的散粉株率和結實株率差異均不顯著。

3 結論與討論

單倍體誘導率受基礎材料和誘導系影響均較大，而散粉株率、結實株率則主要受基礎材料影響，與祁志云[6]等研究結果基本一致。因而在單倍體育種中，根據育種目標選擇合適的基礎材料和誘導系能大幅度提高單倍體育種效率。

基礎材料的單倍體被誘導率從高到低依次是人工合成群體、地方品種、單交種，散粉株率和結實株率從高到低依次是地方品種、人工合成群體、高于單交種。分析其原因可能是因為本研究用的2個人工合成群體是選用10個糯玉米單交種經多年多代混粉合成，遺傳基礎最復雜，因而誘導率偏高，與李高科[12]等研究結果基本一致。而地方品種的散粉株率和結實株率最高則可能因為地方品種經過長期的自然選擇，適應性較人工合成群體和單交種強，因而在育性恢復上偏高。

表5 糯玉米單倍體各性狀差異顯著性分析

基礎材料 擬單倍體率/% 校正單倍體誘導率/% 散粉株率/% 結實株率/% 均值5%顯著水平均值5%顯著水平均值5%顯著水平均值5%顯著水平N15.4c4.3bc12.5a5.7aN25.5bc4.2bc12.6a6.0aN37.0ab5.6a10.6abc5.0abN47.4a5.1ab12.0ab6.0aN54.7c3.5c9.3bc4.1bcN65.2c3.7c7.8c3.7cYD15.5b4.3b9.7a4.9aYD27.2a5.3a11.7a5.4aYD35.0b3.6b11.0a5.0a

注：小寫字母不同表示差異顯著，相同小寫表示差異不顯著。

本研究所選用的3個誘導系中，YD 2的誘導率顯著高于YD 1和YD 3，表明在糯玉米單倍體誘導育種中，可加大對誘導系YD 2的利用。