李星華　李春娜　陳惠麗　黃珊鳳　邵迪　童欣　洪仲思

【摘要】 目的 對艾滋病患者人類免疫缺陷病毒-1型（HIV-1）抗原特異性CD8+記憶性母細胞樣T細胞（TSCM）的擴增進行分析。方法 納入10例HIV-1感染者作為研究對象， 磁珠法分離艾滋病患者CD8+T淋巴細胞， 并利用Tetramer-SL9標記T細胞表面抗原受體。利用流式細胞術檢測標記有流式抗體的HIV-1抗原特異性CD8+ TSCM的分布情況， 利用細胞因子探索其擴增。結果 HIV-1抗原特異性CD8+ TSCM在CD8+ T淋巴細胞中的比例， 隨著時間延長， 可誘導出更多的TSCM細胞， 但是峰值在10 d左右。結論 艾滋病患者CD8+ T細胞中TSCM細胞的存在， 用HIV-1抗原表位（SL9）來標記安全性高， 擴增效果好， 可為艾滋病的過繼免疫治療提供技術參考。

【關鍵詞】 艾滋病;CD8+ T細胞;記憶性母細胞樣T細胞;抗原特異性

【Abstract】 Objective To analyze the amplification of human immunodeficiency virus-1 （HIV-1） antigen-specific CD8+ memory stem T cells （TSCM） in AIDS patients. Methods 10 HIV-1 patients were enrolled in this study. CD8+ T lymphocytes were isolated by magnetic bead method and T cell surface antigen receptors were labeled with Tetramer-SL9. Flow cytometry was used to detect the distribution of HIV-1 antigen-specific CD8+ TSCM labeled with flow antibody， and cytokines were used to explore its amplification. Results The proportion of HIV-1 antigen-specific CD8+ TSCM in CD8+ T lymphocyte can induce more TSCM cells with time prolonging， but the peak value was about 10 d. Conclusion The presence of TSCM cells in CD8+ T cells of AIDS patients is highly safe labeled with HIV-1 epitope （SL9）， and the amplification effect is good. So it may provide a technical reference for adoptive immunotherapy of AIDS.

【Key words】 AIDS; CD8+ T cells; Memory stem T cells; Antigen specificity

基金項目：廣東省醫(yī)學科學技術研究基金（項目編號：A2015047）

作者單位：519000 中山大學附屬第五醫(yī)院

通訊作者：洪仲思

艾滋病目前已成為嚴重的全球公共衛(wèi)生問題[1]。過繼免疫療法是運用生物技術或者生物制劑， 對一定條件下患者體內(nèi)免疫細胞采集、擴增后進行自體回輸， 起到激發(fā)自身免疫功能的作用， 從而達到細胞治療的目的[2]。本文旨在檢測艾滋病患者體內(nèi)HIV-1抗原特異性TSCM細胞的分布以及利用細胞因子進行擴增的情況。

1 資料及方法

1. 1 病例來源 選取10例艾滋病患者均來自中山大學附屬第五醫(yī)院感染病防治中心隨訪病例。

1. 2 試劑和儀器 人外周血淋巴細胞分離液、CD8+ T淋巴細胞陽選磁珠、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、Indo-1AMCell Permeable細胞可滲透鈣離子熒光探針、流式細胞檢測抗體、HLA-A*0201限制的Tetramer SL9（SLYNTATL）-PE、T cell Activation/Expansion Kit、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）[含體積分數(shù)2%的BSA和0.5%的乙二胺四乙酸（EDTA）]、2%多聚甲醛溶液、流式細胞儀（BD公司）。

1. 3 方法

1. 3. 1 外周血采集與處理 從上肢肘窩靜脈取血10 ml， 至EDTA抗凝的負壓采血管（BD公司）。T細胞的分離及培養(yǎng)均在生物安全二級實驗室內(nèi)進行。

1. 3. 2 分離CD8+ T淋巴細胞 利用淋巴細胞分離液， 采用密度梯度離心法獲取外周血單個核細胞（PBMC）， 用PBS緩沖液重懸后加帶有特異性單抗的磁珠， 利用磁珠分選法獲取CD8+ T淋巴細胞， 置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中。

1. 3. 3 流式細胞儀標本制備 ①收集培養(yǎng)板內(nèi)CD8+T細胞離心后PBS緩沖液重懸;②根據(jù)HIV-1抗原特異性TSCM細胞表位特點標記抗體：CD8-Pacific Blue、CD122-APC、CD95-FITC、CD62L-PE CY7、CCR7-Alexa Fluor、CD45RO-PercP CY5.5、CD45RA-Texas Red、indo、Tetramer-SL9-PE。避光冰浴20 min。加PBS緩沖液洗滌1次， 棄上清， 加PBS緩沖液重懸至500 μl， 移液至BD流式細胞管4℃避光保存。

1. 3. 4 上流式細胞儀分析 熒光抗體染色后， 用流式細胞儀分析， 并用flowjo 流式分析軟件對結果進行分析。

1. 3. 5 擴增患者體內(nèi)的抗原特異性的記憶性母細胞樣T淋巴細胞 ①細胞培養(yǎng)：將分離出來的PBMC置于10%含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 添加細胞因子（10 ng/ml Anti-CD3、10 ng/ml Anti-28， 10 ng/ml IL-2）。培養(yǎng)環(huán)境：體積分數(shù)5%CO2、飽和濕度及37℃下。每隔3 d更換新鮮RPMI1640培養(yǎng)液， 補充細胞因子。②每隔5 d添加A2-SL9抗原肽刺激PBMC， 并添加細胞因子[白細胞介素-8（IL-8）、白細胞介素-15（IL-15）]， 5 d后更換培養(yǎng)液及添加補充細胞因子。培養(yǎng)時間15 d。③標記流式抗體及主要組織相容性復合體（MHC）四聚體， 流式篩選抗原特異性TSCM， 計算TSCM比例。

1. 4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2. 1 通過流式細胞技術驗證HIV-1抗原特異性CD8+ TSCM細胞（樣本1） 根據(jù)CD8+ TSCM細胞的表位特點標記流式抗體， HIV-1抗原表位的標記需要四聚體技術， 本實驗選取Tetramer-SL9作為1個抗原表位標記， 其帶有PE顏色標簽， 可以通過流式細胞儀監(jiān)測到。首先通過選定CD8+ T細胞， 然后在CD8+ T細胞中選定CD45RO- CD45RA+的細胞亞群;進一步再選定出CD62L+ CCR7+的細胞亞群， 隨后在這個亞群細胞的基礎上， 選定CD95+并且CD122+雙陽性的細胞， 同時被Tetramer-SL9所標記， 該群細胞就是本研究所要關注的TSCM細胞。見圖1。

2. 2 HIV-抗原特異性TSCM細胞在CD8+T淋巴細胞中的構成 利用結果中的圈門數(shù)據(jù)分別計算10個樣本中HIV-1抗原特異性TSCM細胞在CD8+ T淋巴細胞中所占比例。見圖2。

2. 3 擴增后HIV-抗原特異性TSCM細胞在CD8+T淋巴細胞中的百分比 將患者血樣分為實驗組（添加細胞因子IL-8、IL-15）和對照組（無添加細胞因子）， 分別觀察基線（T0）， 5 d后（T1）， 10 d后（T2）， 15 d后（T3）4個檢測點TSCM細胞在CD8+ T淋巴細胞中的比例。處理前均值為0.0027%， 處理后見圖3。

試驗結果表明， 細胞因子（IL-8、IL-15）可以在體外實驗中擴增CD8+ T淋巴細胞中TSCM細胞的百分比。并且隨著時間延長， 可能誘導出更多的TSCM細胞， 但是峰值在10 d 左右。

3 討論

記憶性T淋巴細胞在機體對感染性疾病和腫瘤的免疫應答中扮演著關鍵角色[3]， TSCM為一群缺乏快速效應細胞功能， 但具有強大增殖及自我更新潛力的細胞亞群， 它能夠持續(xù)地產(chǎn)生記憶細胞亞群和效應細胞亞群， 這些特性使其突破移植低效率、持續(xù)時間短、缺乏調(diào)控持續(xù)免疫攻擊等限制[4-6]。

本實驗將TSCM細胞和艾滋病患者CD8+ T細胞有機地聯(lián)系到一起， 利用四聚體技術標記TSCM細胞表面的HIV-1抗原表位（SL9）來鑒定HIV-1抗原特異性TSCM細胞在艾滋病患者外周血中的存在情況， 實驗結果證明這群細胞的確存在于艾滋病患者體內(nèi)， 但在CD8+ T淋巴細胞中所占比例很低， 而標記HIV-1抗原表位（SL9）有利于更好識別TSCM細胞。

本研究明確了HIV-1抗原特異性TSCM的存在情況， 通過添加細胞因子（IL-8、IL-15）， 可以明顯促進TSCM細胞的形成。與此同時， 隨著CD8+ T細胞數(shù)量的增加， 相應的TSCM細胞在其中的比例也隨之顯著增加， 在第10天達到高峰。但是， 由于細胞在培養(yǎng)過程中隨之時間的推移， 會有不同程度的死亡， 在體外培養(yǎng)的第15天， CD8+ T細胞數(shù)量以及CD8+ T細胞中TSCM細胞的比例也出現(xiàn)下降趨勢。

綜上所述， 本研究證明了艾滋病患者CD8+ T細胞中TSCM細胞的存在， 并采用HIV-1抗原表位（SL9）來標記， 同時初步探索建立利用細胞因子（IL-8、IL-15）可能是促進TSCM細胞進行擴增的有效方法。該方法安全性能高， 擴增效果好， 可為艾滋病的過繼免疫治療提供技術參考。

參考文獻

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[2] 郭寧寧， 王輝， 肖蘭鳳. T細胞過繼免疫治療法在腫瘤疾病治療中的應用進展. 廣東藥學院學報， 2011， 27（4）：441-445.

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[5] 李丹， 鞠斌， 王碩， 等. 通過流式分選技術篩選HIV-1特異性單個B細胞. 中國熱帶醫(yī)學， 2016， 16（11）：1074-1076.

[6] 宋冰冰， 陸小凡， 翁文佳， 等. HIV-1慢性感染者外周血中CD8+ 干細胞樣記憶型T細胞變化以及對疾病進展的影響. 首都醫(yī)科大學學報， 2017， 38（5）：650-653.

[收稿日期：2018-10-25]