吳育羅 涂海旋 官哲
【摘要】 目的 探究癌性血性胸水腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)在體外培養(yǎng)的狀況。方法 使用四甲基偶氮唑鹽(MTT)手段對TIL細胞體外細胞活性進行檢測, 使用酶聯(lián)免疫(ELISA)手段對白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-5(IL-5)、白細胞介素-7(IL-7)及白細胞介素-21(IL-21)水平進行觀察, 將IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平較低的患者分為觀察組(20例), 將IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平較高的患者分為對照組(20例)。觀察并比較兩組患者胸水TIL細胞體外增殖情況及殺瘤活性。結(jié)果 觀察組TIL細胞體外培養(yǎng)8 d后TIL細胞體外增殖(58.4±27.3)倍, 培養(yǎng)12 d后TIL細胞體外增殖擴增為(107.6±44.2)倍, 明顯高于對照組的(22.4±11.2)、(66.7±32.4)倍, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。觀察組TIL細胞體外殺瘤活性(44.7±9.3)%明顯高于對照組的(24.5±6.7)%, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 癌性血性胸水患者中, IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平高低同TIL細胞體外增殖速度及殺瘤活性明顯存在一定的關(guān)聯(lián)性, IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平較低的患者胸水TIL細胞體外增殖速度較快, 殺瘤活性較強。胸水IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平可以作為癌性血性胸水患者臨床免疫治療的參考。
【關(guān)鍵詞】 腫瘤浸潤淋巴細胞;抗腫瘤治療;癌性血性胸水;體外培養(yǎng)
DOI:10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.02.115
腫瘤浸潤淋巴細胞是從淋巴因子激活殺傷細胞(LAK)、殺傷細胞(CIK)之后出現(xiàn)的又一種新型的抗腫瘤效應(yīng)細胞, 因為腫瘤浸潤淋巴細胞的抗瘤活性較強, 回輸后可以特異性集聚在患者腫瘤位置處, 并可以在IL-2存在下進行體外的培養(yǎng)與擴增, 逐漸被應(yīng)用在抗臨床腫瘤治療中[1-3]。有研究發(fā)現(xiàn), 胸水中IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平與TIL細胞的體外擴增及TIL細胞的殺瘤活性有一定關(guān)系[4]。本文主要探究患者胸水中IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平對其TIL細胞在體外培養(yǎng)的影響, 現(xiàn)報告如下。
1 資料與方法
1. 1 一般資料 選擇2016年1月~2018年1月本院收治的40例癌性血性胸水患者, 年齡39~67歲, 平均年齡(56.18±5.52)歲, 所有患者均通過病理學(xué)或細胞學(xué)診斷, 確診為癌性胸水, 胸水量范圍在中等以上(>200 ml), 且未接受癌性血性胸水的其他常規(guī)性治療, 患者生存預(yù)期>3個月。使用ELISA手段對患者胸水IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平進行檢測, 將所有患者按細胞因子水平高低分為兩組, 將IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平較高的20例患者分為對照組, 將IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平較低的20例患者分為觀察組。
1. 2 方法
1. 2. 1 制備方法 無菌條件下收集患者胸水500~1000 ml, 按1∶100的比例加入肝素抗凝, 并使用離心、貼壁分離等手段分離, 并獲得上清與TIL細胞。具體步驟如下:通過
2000 r/min離心10 min, 獲取上清。使用PBS洗滌細胞2次, 然后再懸在20 ml的PBS中。在兩個15 ml離心管內(nèi)加入淋巴細胞分離液體5 ml, 并小心添加上述細胞懸液各10 ml, 2000 r/min離心20 min, 淋巴細胞分離液界面上對云霧樣細胞層細胞進行收集, PBS離心洗滌細胞, 按1∶10的體積添加紅細胞裂解液裂解5 min, PBS洗滌細胞1次, 培養(yǎng)液洗滌1次, 加入含10%的牛血清的培養(yǎng)液并轉(zhuǎn)移到175 cm2培養(yǎng)瓶中, 在37℃, 5% CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)40 min。輕搖培養(yǎng)瓶, 取懸浮細胞培養(yǎng)TIL細胞, 貼壁細胞培養(yǎng)腫瘤細胞。
1. 2. 2 TIL細胞體外培養(yǎng)及其增殖能力測定 用含IL-2 的500 U/ml的10%牛血清培養(yǎng)液把TIL細胞調(diào)整為濃度5×
105個/ml, 轉(zhuǎn)移到預(yù)包被CD3單抗的6孔板中, 在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 每隔48 h添加倍量的培養(yǎng)液進行擴增。每96 h對TIL細胞增殖數(shù)量進行常規(guī)計數(shù)。
1. 2. 3 MTT法檢測TIL細胞體外殺瘤活性 使用MTT法檢測TIL細胞對自身腫瘤細胞的殺傷活性。將TIL細胞和腫瘤細胞濃度分別調(diào)整為2×106個/ml。兩者按10∶1混合, 并設(shè)立效應(yīng)細胞和靶細胞對照, 在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 加入MTT再培養(yǎng)2 h, 加入DMSO混勻。酶標儀測定OD值, 并計算TIL細胞殺瘤活性:TIL細胞活性=[1-(實驗組OD值-效應(yīng)細胞組OD值)/靶細胞OD值]×100.0%。
1. 3 觀察指標 觀察兩組患者TIL細胞體外增殖能力及其體外殺瘤活性。
1. 4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差( x-±s)表示, 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2. 1 兩組患者TIL細胞體外增殖能力比較 觀察組TIL細胞體外培養(yǎng)8 d后TIL細胞體外增殖(58.4±27.3)倍, 培養(yǎng)12 d后TIL細胞體外增殖擴增為(107.6±44.2)倍, 明顯高于對照組的(22.4±11.2)、(66.7±32.4)倍, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。
2. 2 兩組患者TIL細胞體外殺瘤活性比較 觀察組TIL細胞體外殺瘤活性(44.7±9.3)%明顯高于對照組的(24.5±6.7)%,?差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。
3 討論
晚期惡性腫瘤常伴有惡性胸腔積液, 這與腫瘤胸膜轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。臨床上常用平陽霉素(BLM)、絲裂霉素C(MMC)及順鉑 (DDP)等化療藥物行胸腔內(nèi)注射治療[4]。但大多患者由于病期較晚、身體狀況較差, 其臨床治療效果并不佳, 而且不良反應(yīng)也較大[5]。而TIL細胞來自于患者腫瘤引流淋巴結(jié)、惡性胸腔積液、實體瘤以及腹水, 通過誘導(dǎo)并激活, 其存在著很大的優(yōu)勢:①具有較強的抗腫瘤效應(yīng)?;颊邜盒阅[瘤間質(zhì)中含有TIL細胞, 具有一定的靶細胞特異性, 在體外激活擴增后可以特異性殺傷腫瘤細胞, 其殺瘤活性強于LAK細胞50~100倍[6-8]。②TIL細胞能夠聚集至腫瘤處, 并對自體腫瘤細胞存在著特異殺傷活性。患者腫瘤內(nèi)TIL細胞含量越多, 預(yù)后越佳, 這說明TIL細胞在抗腫瘤中發(fā)揮著重要作用。由于TIL細胞對惡性腫瘤的治療作用, 已經(jīng)成為國內(nèi)外惡性腫瘤免疫治療的一項備受關(guān)注的熱點。本文主要研究癌性血性胸水患者IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平對其TIL細胞在體外培養(yǎng)的影響。經(jīng)探究表明, 觀察組TIL細胞體外培養(yǎng)8 d后TIL細胞體外增殖(58.4±27.3)倍, 培養(yǎng)12 d后TIL細胞體外增殖擴增為(107.6±44.2)倍, 明顯高于對照組的(22.4±11.2)、(66.7±32.4)倍, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。觀察組TIL細胞體外殺瘤活性(44.7±9.3)%明顯高于對照組的(24.5±6.7)%, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。本結(jié)果提示了IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平較低的患者胸水中分離出的TIL細胞增殖速度較快, 且具有較強的抗腫瘤活性。這是因為IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平較低的患者體內(nèi)細胞因子水平較低, 對體內(nèi)淋巴細胞的增殖與激活有一定的影響, 進而使其體內(nèi)TIL、細胞毒T淋巴細胞 (CTL)以及自然殺傷細胞(NK)等免疫細胞的增殖速度變慢, 殺瘤活性也隨之變低。在體外培養(yǎng)TIL細胞時, 由于給予充分的細胞因子, TIL細胞抗腫瘤活性也會加大, 并且細胞增殖速率也會提高。而對于IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平較高的患者, 可能存在細胞因子與淋巴細胞間傳遞信息上的障礙, 進而使淋巴細胞對其反應(yīng)性變差, 因此, TIL在體外增殖速率降低, 其體外殺瘤活性的能力變差。綜上所述, 在治療癌性血性胸水患者前, 檢測IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平可以為是否適合實施TIL細胞免疫治療提供一定的臨床依據(jù)。
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[收稿日期:2018-10-18]