吳育羅 涂海旋 官哲

【摘要】 目的 探究癌性血性胸水腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）在體外培養(yǎng)的狀況。方法 使用四甲基偶氮唑鹽（MTT）手段對TIL細胞體外細胞活性進行檢測， 使用酶聯(lián)免疫（ELISA）手段對白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-5（IL-5）、白細胞介素-7（IL-7）及白細胞介素-21（IL-21）水平進行觀察， 將IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平較低的患者分為觀察組（20例）， 將IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平較高的患者分為對照組（20例）。觀察并比較兩組患者胸水TIL細胞體外增殖情況及殺瘤活性。結(jié)果 觀察組TIL細胞體外培養(yǎng)8 d后TIL細胞體外增殖（58.4±27.3）倍， 培養(yǎng)12 d后TIL細胞體外增殖擴增為（107.6±44.2）倍， 明顯高于對照組的（22.4±11.2）、（66.7±32.4）倍， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。觀察組TIL細胞體外殺瘤活性（44.7±9.3）%明顯高于對照組的（24.5±6.7）%， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 癌性血性胸水患者中， IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平高低同TIL細胞體外增殖速度及殺瘤活性明顯存在一定的關(guān)聯(lián)性， IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平較低的患者胸水TIL細胞體外增殖速度較快， 殺瘤活性較強。胸水IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平可以作為癌性血性胸水患者臨床免疫治療的參考。

【關(guān)鍵詞】 腫瘤浸潤淋巴細胞;抗腫瘤治療;癌性血性胸水;體外培養(yǎng)

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.02.115

腫瘤浸潤淋巴細胞是從淋巴因子激活殺傷細胞（LAK）、殺傷細胞（CIK）之后出現(xiàn)的又一種新型的抗腫瘤效應(yīng)細胞， 因為腫瘤浸潤淋巴細胞的抗瘤活性較強， 回輸后可以特異性集聚在患者腫瘤位置處， 并可以在IL-2存在下進行體外的培養(yǎng)與擴增， 逐漸被應(yīng)用在抗臨床腫瘤治療中[1-3]。有研究發(fā)現(xiàn)， 胸水中IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平與TIL細胞的體外擴增及TIL細胞的殺瘤活性有一定關(guān)系[4]。本文主要探究患者胸水中IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平對其TIL細胞在體外培養(yǎng)的影響， 現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選擇2016年1月～2018年1月本院收治的40例癌性血性胸水患者， 年齡39～67歲， 平均年齡（56.18±5.52）歲， 所有患者均通過病理學(xué)或細胞學(xué)診斷， 確診為癌性胸水， 胸水量范圍在中等以上（>200 ml）， 且未接受癌性血性胸水的其他常規(guī)性治療， 患者生存預(yù)期>3個月。使用ELISA手段對患者胸水IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平進行檢測， 將所有患者按細胞因子水平高低分為兩組， 將IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平較高的20例患者分為對照組， 將IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平較低的20例患者分為觀察組。

1. 2 方法

1. 2. 1 制備方法 無菌條件下收集患者胸水500～1000 ml， 按1∶100的比例加入肝素抗凝， 并使用離心、貼壁分離等手段分離， 并獲得上清與TIL細胞。具體步驟如下：通過

2000 r/min離心10 min， 獲取上清。使用PBS洗滌細胞2次， 然后再懸在20 ml的PBS中。在兩個15 ml離心管內(nèi)加入淋巴細胞分離液體5 ml， 并小心添加上述細胞懸液各10 ml， 2000 r/min離心20 min， 淋巴細胞分離液界面上對云霧樣細胞層細胞進行收集， PBS離心洗滌細胞， 按1∶10的體積添加紅細胞裂解液裂解5 min， PBS洗滌細胞1次， 培養(yǎng)液洗滌1次， 加入含10%的牛血清的培養(yǎng)液并轉(zhuǎn)移到175 cm2培養(yǎng)瓶中， 在37℃， 5% CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)40 min。輕搖培養(yǎng)瓶， 取懸浮細胞培養(yǎng)TIL細胞， 貼壁細胞培養(yǎng)腫瘤細胞。

1. 2. 2 TIL細胞體外培養(yǎng)及其增殖能力測定 用含IL-2 的500 U/ml的10%牛血清培養(yǎng)液把TIL細胞調(diào)整為濃度5×

105個/ml， 轉(zhuǎn)移到預(yù)包被CD3單抗的6孔板中， 在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 每隔48 h添加倍量的培養(yǎng)液進行擴增。每96 h對TIL細胞增殖數(shù)量進行常規(guī)計數(shù)。

1. 2. 3 MTT法檢測TIL細胞體外殺瘤活性 使用MTT法檢測TIL細胞對自身腫瘤細胞的殺傷活性。將TIL細胞和腫瘤細胞濃度分別調(diào)整為2×106個/ml。兩者按10∶1混合， 并設(shè)立效應(yīng)細胞和靶細胞對照， 在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h， 加入MTT再培養(yǎng)2 h， 加入DMSO混勻。酶標儀測定OD值， 并計算TIL細胞殺瘤活性：TIL細胞活性=[1-（實驗組OD值-效應(yīng)細胞組OD值）/靶細胞OD值]×100.0%。

1. 3 觀察指標 觀察兩組患者TIL細胞體外增殖能力及其體外殺瘤活性。

1. 4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 兩組患者TIL細胞體外增殖能力比較 觀察組TIL細胞體外培養(yǎng)8 d后TIL細胞體外增殖（58.4±27.3）倍， 培養(yǎng)12 d后TIL細胞體外增殖擴增為（107.6±44.2）倍， 明顯高于對照組的（22.4±11.2）、（66.7±32.4）倍， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2. 2 兩組患者TIL細胞體外殺瘤活性比較 觀察組TIL細胞體外殺瘤活性（44.7±9.3）%明顯高于對照組的（24.5±6.7）%，?差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

晚期惡性腫瘤常伴有惡性胸腔積液， 這與腫瘤胸膜轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。臨床上常用平陽霉素（BLM）、絲裂霉素C（MMC）及順鉑 （DDP）等化療藥物行胸腔內(nèi)注射治療[4]。但大多患者由于病期較晚、身體狀況較差， 其臨床治療效果并不佳， 而且不良反應(yīng)也較大[5]。而TIL細胞來自于患者腫瘤引流淋巴結(jié)、惡性胸腔積液、實體瘤以及腹水， 通過誘導(dǎo)并激活， 其存在著很大的優(yōu)勢：①具有較強的抗腫瘤效應(yīng)?；颊邜盒阅[瘤間質(zhì)中含有TIL細胞， 具有一定的靶細胞特異性， 在體外激活擴增后可以特異性殺傷腫瘤細胞， 其殺瘤活性強于LAK細胞50～100倍[6-8]。②TIL細胞能夠聚集至腫瘤處， 并對自體腫瘤細胞存在著特異殺傷活性。患者腫瘤內(nèi)TIL細胞含量越多， 預(yù)后越佳， 這說明TIL細胞在抗腫瘤中發(fā)揮著重要作用。由于TIL細胞對惡性腫瘤的治療作用， 已經(jīng)成為國內(nèi)外惡性腫瘤免疫治療的一項備受關(guān)注的熱點。本文主要研究癌性血性胸水患者IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平對其TIL細胞在體外培養(yǎng)的影響。經(jīng)探究表明， 觀察組TIL細胞體外培養(yǎng)8 d后TIL細胞體外增殖（58.4±27.3）倍， 培養(yǎng)12 d后TIL細胞體外增殖擴增為（107.6±44.2）倍， 明顯高于對照組的（22.4±11.2）、（66.7±32.4）倍， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。觀察組TIL細胞體外殺瘤活性（44.7±9.3）%明顯高于對照組的（24.5±6.7）%， 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。本結(jié)果提示了IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平較低的患者胸水中分離出的TIL細胞增殖速度較快， 且具有較強的抗腫瘤活性。這是因為IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平較低的患者體內(nèi)細胞因子水平較低， 對體內(nèi)淋巴細胞的增殖與激活有一定的影響， 進而使其體內(nèi)TIL、細胞毒T淋巴細胞 （CTL）以及自然殺傷細胞（NK）等免疫細胞的增殖速度變慢， 殺瘤活性也隨之變低。在體外培養(yǎng)TIL細胞時， 由于給予充分的細胞因子， TIL細胞抗腫瘤活性也會加大， 并且細胞增殖速率也會提高。而對于IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平較高的患者， 可能存在細胞因子與淋巴細胞間傳遞信息上的障礙， 進而使淋巴細胞對其反應(yīng)性變差， 因此， TIL在體外增殖速率降低， 其體外殺瘤活性的能力變差。綜上所述， 在治療癌性血性胸水患者前， 檢測IL-2、IL-15、IL-7及IL-21水平可以為是否適合實施TIL細胞免疫治療提供一定的臨床依據(jù)。

參考文獻

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[收稿日期：2018-10-18]