杜睿 張羽玲 曾嘉發(fā) 方明亮 Sasho Gligorovski 周振 李雪

摘?要?二次電噴霧電離質(zhì)譜（Secondary electrospray ionization mass spectrometry， SESI-MS）可實(shí)時在線檢測人體呼出氣中的揮發(fā)性有機(jī)化合物（Volatile organic compounds， VOCs），但呼出氣中VOCs的電離效率會受到源內(nèi)氣體氛圍的影響。本研究在自制SESI源的基礎(chǔ)上，以超高分辨質(zhì)譜（Ultra-high resolution mass spectrometer， UHRMS）為分析技術(shù)，以人體呼出氣中典型內(nèi)源性化合物丙酮（Acetone）和吲哚（Indole），以及典型基質(zhì)鄰苯二甲酸酐（Phthalic anhydride， PA）和鄰苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate，DP）為目標(biāo)化合物，初步探究了SESI源內(nèi)不同氣體氛圍（氮?dú)猓∟2）、二氧化碳（CO2）、純凈零氣（Zero air））對目標(biāo)VOCs電離效率的影響。結(jié)果表明，在SESI源內(nèi)通入3種純凈氣體，可有效提高呼出氣中丙酮和吲哚的信號強(qiáng)度和信噪比;同時，由于降低了源內(nèi)基質(zhì)含量，可顯著減弱基質(zhì)干擾。3種純凈氣體中，通入N2后的效果最為顯著。本研究結(jié)果可為SESI源設(shè)計及參數(shù)設(shè)置、呼出氣分析方法開發(fā)提供重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞?呼氣代謝組; 直接質(zhì)譜分析; 超高分辨質(zhì)譜; 二次電噴霧電離; 氣體氛圍

1?引 言

二次電噴霧電離質(zhì)譜（Secondary electrospray ionization mass spectrometry，SESI-MS）可實(shí)時在線檢測人體呼出氣中揮發(fā)性化學(xué)成分（Volatile organic compounds，VOCs）[1]，具有無損、實(shí)時、無需樣品前處理、高通量等優(yōu)勢，已成功用于人體生物鐘[2]、診斷肺部疾病[3]、檢測人體呼出氣中內(nèi)源性代謝物（如色氨酸）[4]等生物醫(yī)學(xué)研究中。SESI源工作原理為：在常溫常壓環(huán)境中，呼氣中的中性分子被電噴霧產(chǎn)生的初級離子電離生成分子離子[2，5～8]（圖1）。SESI技術(shù)的雛形，即電噴霧形成帶電微滴電離氣相分子的概念，由Fenn等于1989年首次提出[9]; 2000年，Wu和Hill將這種電離技術(shù)命名為SESI[10]。目前，文獻(xiàn)中報道的SESI源，都是自制SESI源，直至2018年才有一款商品化SESI源在展會中出現(xiàn)[11]。SESI源易于自組建，且可與多種商業(yè)質(zhì)譜接口耦合[12～14]。從質(zhì)量分析器的角度，以超高分辨質(zhì)譜（Ultrahigh resolution mass spectrometer，UHRMS）與SESI源結(jié)合，優(yōu)勢最顯著。采用UHRMS，根據(jù)準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)，能提高定性分析的準(zhǔn)確性，有效區(qū)分同重素[15]。

由于自制SESI源不完全封閉，室內(nèi)空氣會進(jìn)入源內(nèi)，與呼出氣中待分析的目標(biāo)化合物（如丙酮、吲哚）競爭初級ESI電噴霧形成的微液滴上的有限電荷，降低目標(biāo)物的電離效率及檢出靈敏度; 而且，對于同時存在于呼出氣與室內(nèi)空氣中的VOCs，也會降低目標(biāo)化合物的信噪比。在SESI源內(nèi)通入不含VOCs的純凈氣體，通過降低源內(nèi)基質(zhì)濃度，或可解決上述問題。但目前尚沒有SESI源內(nèi)純凈氣體氛圍對呼出VOCs以及基質(zhì)的電離效率的影響研究。

本研究利用自行搭建的SESI源，以呼出氣中典型內(nèi)源性代謝物丙酮（Acetone）[2，13]和吲哚（Indole）[12]，以及室內(nèi)空氣中典型VOCs鄰苯二甲酸酐（Phthalic anhydride，PA）[16，17]和鄰苯二甲酸二丁酯（Dibutyl phthalate，DP）[18]為目標(biāo)化合物，以UHRMS為檢測手段，探究源內(nèi)不同純凈氣體氛圍（氮?dú)猓∟2）、二氧化碳（CO2）、純凈零級空氣（Zero air，包含： 79% N2，21% O2，< 1 part per million by volume（ppmv）烷烴類物質(zhì)））對SESI源電離不同來源VOCs的影響，為優(yōu)化離子源設(shè)計及參數(shù)設(shè)置、提高呼出氣中VOCs檢測信噪比提供了依據(jù)。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

QExactiveTM四極桿組合靜電場軌道阱傅里葉變換超高分辨質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）; 自制SESI源是將nanoESI商品源與自制質(zhì)譜接口組合而成（圖2）： nanoESI源（美國Thermo Fisher Scientific公司），自制質(zhì)譜接口[6]（廣州禾信儀器股份有限公司定制），包括一個離子化反應(yīng)腔和兩個進(jìn)樣管（圖2A），均為不銹鋼材質(zhì)，目的在于減少呼出VOCs的吸附，同時，進(jìn)樣管與腔體為可拆卸設(shè)計，便于定期清理; Milli-Q Integral 5超純水儀（密理博中國有限公司）; AJH-3080A零氣發(fā)生器（北京安捷華科技有限公司）。

標(biāo)準(zhǔn)校正液（美國Thermo Fisher Scientific公司）; 甲醇（色譜級，純度99.9%，美國默克公司）。N2標(biāo)準(zhǔn)氣體（純度 ≥ 99.999%，佛山市佛鋼氣體有限公司）; CO2標(biāo)準(zhǔn)氣體（純度99.99%，廣州市粵佳氣體有限公司）。醫(yī)療呼吸氣體干燥（Nafion）管（內(nèi)徑1.32 mm，長度60 cm，ME 60系列，美國博純有限責(zé)任公司）; 特氟龍（PTFE）管（內(nèi)徑4 mm，上海畢帝塑料公司）; 聚氨酯（Polyurethane，PU）管（內(nèi)徑2 mm， 上海畢帝塑料公司）。1 mL移液槍頭（德國Eppendorf公司）。質(zhì)量流量控制器（量程0～1 L/min，韓國Line Tech公司）; Lzb-3微型玻璃轉(zhuǎn)子流量計（量程0～0.6 L/min，浙江余姚工業(yè)自動化儀表廠）。

2.2?樣品分析

2.2.1?樣品采集?人體呼出氣采樣流程參見文獻(xiàn)[6]，即志愿者（2名，25歲和29歲，女性）通過鼻吸、嘴呼的方式提供呼出氣樣品。采樣前，志愿者用純水漱口，并在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)靜坐30 min[2]。采集呼氣時，志愿者先深呼吸3次，再采集全呼氣[18～20]，一次性呼氣吹嘴由1 mL移液槍頭改制而成。樣品傳輸管路包括： Nafion管、PTFE管和Lzb-3微型玻璃轉(zhuǎn)子流量計。Nafion管用于去除呼出氣中的水汽，避免水汽冷凝在PTFE管內(nèi)壁、吸附VOCs[6]; PTFE管可減少VOCs吸附損失; Lzb-3微型玻璃轉(zhuǎn)子流量計用于控制呼出氣流速。還需說明的是，ID 1.32 mm的Nafion管所允許的最大氣體流量為0.4 L/min，所以單次采樣時，呼氣流速控制為0.4 L/min。每個實(shí)驗(yàn)條件下，每位志愿者重復(fù)呼氣5～6次。

2.2.2?SESI-UHRMS分析?SESI-UHRMS實(shí)時在線檢測呼出氣裝置如圖2B所示。SESI源有兩個進(jìn)樣口： 呼出氣樣品的進(jìn)樣口和純凈氣體的進(jìn)樣口（未通入純凈氣體時，源內(nèi)為室內(nèi)空氣）（圖2A）。ESI溶劑為超純水（電阻率18.2 MΩ·cm），流速200 nL/min。 ESI電壓為+2.5 kV（正離子檢測模式）/2.5 kV（負(fù)離子檢測模式），質(zhì)譜接口離子傳輸管溫度為150℃。檢測模式： 正負(fù)離子切換掃描（切換時間0.01 s）; 全掃描，質(zhì)量數(shù)范圍m/z 50～300，質(zhì)譜質(zhì)量分辨率為140000 FWHM（m/z 200）。

2.3?數(shù)據(jù)處理

通過軟件Xcalibur 3.0確定目標(biāo)化合物以及質(zhì)量偏差。通過軟件Origin 9.0中“Statistics”功能的“Descriptive Statistics”，“Normality Test”判斷原始數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布; 并通過“Homogeneity of Variance Test”，“Levene's Test”進(jìn)行方差齊性分析，用One-way ANOVA方法，進(jìn)行差異性分析，通過均值比較（Means comparision）中的多重比較方法（Tukey's multiple means comparison test）進(jìn)行組內(nèi)差異性對比分析。

3?結(jié)果與討論

3.1?定性分析

以N2氛圍下SESI-UHRMS實(shí)時在線檢測人體呼出氣的結(jié)果為例，志愿者呼出氣一級質(zhì)譜圖（背景已扣除）如圖3所示。

根據(jù)目標(biāo)化合物的分子結(jié)構(gòu)特征和質(zhì)子親和力[22～24]，結(jié)合SESI源電離機(jī)理[15，25，26]，可知丙酮[2，13]、吲哚[12]、PA[16，17]和DP[18]均會形成質(zhì)子化分子離子[M + H]+。在志愿者呼氣樣品實(shí)時監(jiān)測過程中，在m/z 59.0499、118.0651、149.0230和279.1582處分別檢測到質(zhì)譜峰，元素組成鑒別為[C3H7O]+、[C8H8N]+、[C8H5O3]+和[C16H23O4]+，質(zhì)量偏差（實(shí)測值與理論值的差值）為0.8、0.0、0.3和0.9 mDa，可確定上述質(zhì)譜峰即為呼出氣中丙酮、吲哚及室內(nèi)空氣中PA和DP的質(zhì)子化分子離子（圖4）。

3.2?SESI源內(nèi)氣體氛圍對呼出VOCs的影響

本研究選擇N2、CO2、Zero air作為考察的純凈氣體，主要基于如下原因： （1）3種氣體理化性質(zhì)相對穩(wěn)定，且都是呼出氣中的成分（按體積比計算，呼出氣包含： 78.14% N2，13.6%～16% O2，4.0%～5.3% CO2，5% 水汽，1 ppmv VOCs，1 ppmv氨氣）; （2）不易爆炸，相對安全; （3）是實(shí)驗(yàn)室常用標(biāo)準(zhǔn)氣體，易于獲取。

當(dāng)源內(nèi)氣體氛圍為N2，充入流速分別為0.1和0.8 L/min時，丙酮檢出強(qiáng)度增加約9倍， 信噪比（S/N）提高約2倍（表1），吲哚信號強(qiáng)度增加約6倍（表1）。值得注意的是，對比SESI源內(nèi)未通入N2與N2通入流速為0.1 L/min時呼出氣的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)丙酮信號沒有顯著差別，而吲哚的信號增強(qiáng)約2倍，且信號重現(xiàn)性（RSD）得到改善，RSD由55%減小為10%。

與N2結(jié)果相似（表1，圖5），CO2氛圍下，當(dāng)充入流速為0.8 L/min時，相比于0.1 L/min，丙酮和吲哚的信號強(qiáng)度分別提高約1倍和4倍; 對于Zero air，當(dāng)充入流速為0.8 L/min 時，相比于0.1 L/min，丙酮和吲哚的信號強(qiáng)度分別提高約11倍和9倍。對比未通入CO2、Zero air與0.1 L/min 的CO2、Zero air氛圍下呼出氣的檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)丙酮和吲哚的信號均沒有顯著差別，且在這兩種氛圍氣體下，呼出氣中吲哚信號的重現(xiàn)性未得到顯著改善。

綜上，當(dāng)以0.8 L/min的流速向源內(nèi)充入N2、CO2和Zero air時，呼出氣中吲哚及丙酮的檢出強(qiáng)度均明顯提高（圖5）。

在純凈氣體充入流速均為0.8 L/min的條件下，對呼出氣中丙酮及吲哚的檢出信號強(qiáng)度進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，結(jié)果滿足單因素方差分析（ANOVA analysis）的條件。ANOVA結(jié)果（圖6）表明，當(dāng)顯著性水平為0.05時，丙酮（Prob>F： 1.0 ×10?8; F Value 89.8）及吲哚（Prob>F： 3.7 ×10?5; F Value 23.1）在N2、CO2、Zero air氣體氛圍下的檢出強(qiáng)度均存在顯著性差異。丙酮在Zero air 氛圍下的強(qiáng)度均值略高于N2氛圍下的結(jié)果，CO2氛圍下最低; 吲哚在N2氛圍下的信號強(qiáng)度高于Zero air和CO2氛圍下的結(jié)果。進(jìn)一步對比3種純凈氣體氛圍兩兩之間的差異性，多重比較分析結(jié)果（圖7）表明，在顯著性水平為0.05時，呼出氣中丙酮的信號在N2與CO2之間（Prob： 2.4 ×10?6，Sig=1）、CO2與Zero air之間（Prob： 0，Sig=1）及N2和Zero air之間（Prob： 3.3 ×10?4，Sig=1）均存在顯著性差異; 呼出氣中吲哚的信號在N2與CO2之間（Prob： 2.9 ×10?5，Sig=1）、N2和Zero air之間（Prob： 0.002，Sig=1）均存在顯著性差異，而在CO2與Zero air之間（Prob： 0.1，Sig=0）不存在顯著差異。呼出氣中丙酮及吲哚的信號在N2和Zero air之間的差異顯著性均最小，推測主要是由于Zero air的主要成分為N2（79%）。綜上，為提高SESI-MS檢測呼氣中內(nèi)源性VOCs的靈敏度，可在自制SESI源中通入N2。

3.3?SESI源內(nèi)氣體氛圍對基質(zhì)的影響

分析SESI源內(nèi)氣體氛圍對基質(zhì)的影響，結(jié)果表明，以N2氛圍為例，當(dāng)通入氣體流速分別為0.1和0.8 L/min時，即當(dāng)充入N2流速提高8倍時，PA和DP的信號強(qiáng)度分別減少約0.6和0.1倍（表2）。此結(jié)果與3.2節(jié)中呼出氣中VOCs的檢出情況相反，推測可能是SESI源內(nèi)純凈氣體含量增加后，基質(zhì)在源內(nèi)含量降低，進(jìn)而檢出強(qiáng)度降低。此外，N2通入流速為0.1 L/min時的結(jié)果與未通入N2的結(jié)果沒有顯著差別，表明此時源內(nèi)N2含量還無法影響信號檢出效果，此結(jié)論與呼出氣中丙酮的檢出結(jié)果一致（表1和表2）。

氣體氛圍為CO2和Zero air時，趨勢與N2相似（表2，圖8），當(dāng)充入氣體流速為0.8 L/min時，相比于0.1 L/min氣體流速，PA和DP的信號強(qiáng)度分別減少約0.5和0.1倍。

值得注意的是，當(dāng)實(shí)時檢測呼氣時，PA和DP信號強(qiáng)度，在N2、CO2氣體氛圍中，呈降低趨勢，而在Zero air氛圍中出現(xiàn)進(jìn)樣峰，本研究組將會在后續(xù)工作中進(jìn)一步探究這一現(xiàn)象。

8; F Value 69.6）在3種氣體氛圍下檢出信號穩(wěn)定，且檢出強(qiáng)度均存在顯著性差異; 并且，在N2氛圍下PA和DP的信號強(qiáng)度均低于Zero air和CO2氛圍下的結(jié)果，說明N2氛圍對降低背景基質(zhì)干擾的影響最大。

進(jìn)一步對比0.8 L/min流速下3種純凈氣體氛圍兩兩之間的差異性，結(jié)果（圖10）表明，8，Sig=1）CO2與Zero air之間（Prob： 4.6 ×10?6， Sig=1）也均存在顯著性差異。Zero air是造成PA及DP信號強(qiáng)度差異顯著的主要原因。上述結(jié)果說明，N2氛圍對于降低基質(zhì)PA及DP干擾的效果最好，而Zero air氛圍最差。

綜上，自制SESI源內(nèi)通入足夠量的純凈N2，可以顯著增強(qiáng)呼出氣中丙酮及吲哚的信號強(qiáng)度，同時顯著降低基質(zhì)信號強(qiáng)度。此外，由于N2為惰性氣體，性質(zhì)穩(wěn)定，不會對呼氣裝置有影響，不易與其它物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，因此適宜作為SESI-UHRMS檢測呼出氣時的SESI源內(nèi)的氣體氛圍。

4?結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，充入一定流速的純凈氣體，可以增強(qiáng)提高呼出氣中丙酮和吲哚的電離效率; 同時，源內(nèi)純凈氣體含量增加后，能有效降低源內(nèi)PA和DA含量，進(jìn)而降低基質(zhì)檢出強(qiáng)度。3種純凈氣體氛圍中，以N2對呼出氣中丙酮和吲哚的增強(qiáng)效果以及對基質(zhì)PA和DA的降低效果，最為顯著。在后續(xù)研究中，還需以有效提高目標(biāo)物的信噪比、降低基質(zhì)干擾為目標(biāo)，更系統(tǒng)、深入地探索氣體氛圍對呼出VOCs的影響機(jī)制，如通過加入不同氣體體積比例N2和O2或N2和CO2混合氣體，拓寬流速范圍，以更好地理解氣體氛圍理化性質(zhì)對電離效率的影響機(jī)制，為優(yōu)化SESI源內(nèi)氣體氛圍、研制SESI商品源、建立SESI-MS呼氣檢測方法提供理論依據(jù)。

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