張琪 張紅 周強(qiáng) 徐炎碩 王顏紅

摘?要?將光子晶體技術(shù)和分子印跡技術(shù)相結(jié)合，制備了分子印跡光子晶體傳感器（MIPC），用于檢測農(nóng)藥滅多威。以直徑320 nm的 SiO2微球制備的光子晶體為制孔模板，滅多威為印跡模板分子，甲基丙烯酸和丙烯酰胺為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，經(jīng)過熱聚合后形成凝膠薄膜，將SiO2微球和滅多威分子洗脫后得到滅多威MIPC。通過掃描電子顯微鏡對聚合物薄膜的形貌進(jìn)行了表征，發(fā)現(xiàn)薄膜中形成了具有典型面心立方結(jié)構(gòu)的三維互連大孔陣列。通過測試其反射峰的位置變化，研究了此MIPC在滅多威溶液中的響應(yīng)性能，結(jié)果表明，MIPC膜對目標(biāo)分子滅多威具有良好的特異性響應(yīng)。當(dāng)滅多威溶液濃度在0～0.02 g/L變化時，反射峰從533 nm紅移至589 nm，表觀顏色由綠色變?yōu)槌燃t色，響應(yīng)時間僅為13 min，而與其分子結(jié)構(gòu)相似的克百威則沒有出現(xiàn)明顯的反射峰位移。測試了此傳感器在實際樣品中的實用性。當(dāng)MIPC浸入滅多威含量為0.002、0.02和0.2 mg/L的白菜樣品基質(zhì)溶液時，MIPC反射峰偏移量分別為28、34和42 nm，表明在復(fù)雜基質(zhì)中此傳感器具有良好的選擇性和高靈敏度的響應(yīng)能力。

關(guān)鍵詞?光子晶體; 分子印跡; 傳感器; 滅多威

1?引 言

滅多威（Methomyl）是一種內(nèi)吸型廣譜性氨基甲酸酯類殺蟲劑，其殺傷力強(qiáng)、見效快，被廣泛用于果樹、煙草、蔬菜和棉花等作物害蟲的防治[1]。由于滅多威使用量大、溶解性較強(qiáng)、半衰期長[2]，導(dǎo)致在部分水體、果蔬、土壤中均能監(jiān)測到滅多威殘留。滅多威的毒理學(xué)研究表明，其具有較強(qiáng)的急性毒性[3～5]、生理生化毒性[6～8]和一定的遺傳毒性[9，10]，對生物資源及人類健康造成了嚴(yán)重威脅[11]。因此，需要嚴(yán)格控制水體及果蔬中滅度威的殘留量。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-食品中農(nóng)藥最大殘留限量[12]規(guī)定，滅多威在果蔬中的最大殘留限量為0.2 mg/kg。目前，檢測滅多威的方法有氣相色譜法[13]、氣相色譜-質(zhì)譜法[14]、高效液相色譜法[15，16]和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17]，盡管這些方法具有高靈敏度、高特異性等優(yōu)點，但也存在設(shè)備要求高、前處理過程復(fù)雜、成本高、耗時長等缺點。因此，發(fā)展簡單、快速、低成本、高靈敏度的檢測滅多威的方法十分必要。

光子晶體（Photonic crystal，PC）[18，19]是指介電常數(shù)（折射率）在空間呈周期性變化的一類材料，其光子帶隙特性可以通過結(jié)構(gòu)色[20]變化直觀地反映外界所施加的刺激條件，具有響應(yīng)迅速、無需標(biāo)記、裸眼可視等優(yōu)點，是適用于食品安全快速檢測領(lǐng)域理想的光學(xué)傳感材料。但光子晶體本身沒有選擇性，用于分析外界刺激時缺乏特異性。

分子印跡技術(shù)（Molecular imprinting technique，MIT）以某一特定目標(biāo)分子為模板分子，構(gòu)建對該分子具有特異選擇識別性能的分子印跡聚合物（Molecular imprinting polymers，MIPs）[21，22]。該技術(shù)類似抗體抗原的作用機(jī)理，模板分子與功能單體接觸會形成多重作用點，除去模板分子后的聚合物中，存在與模板分子在形狀、功能基團(tuán)、空間位置等方面相匹配的立體孔穴，對模板分子表現(xiàn)出高度的選擇識別特性[23]。分子印跡聚合物具有預(yù)定性和特異性，以及抗惡劣環(huán)境能力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、使用壽命長等優(yōu)點，可作為刺激響應(yīng)性識別元件應(yīng)用于光子晶體傳感器中。

將分子印跡技術(shù)和光子晶體傳技術(shù)結(jié)合，制備出具有分子識別自表達(dá)特性的分子印跡光子晶體（Molecularly imprinted photonic crystal，MIPC），其對特定分子識別的過程可直接通過有序大孔的光子晶體衍射光信號表達(dá)出來，當(dāng)衍射光的位置移動較大時，會伴隨著結(jié)構(gòu)色的變化，可方便地通過裸眼進(jìn)行觀察。目前，已用于L-多巴胺[24]、香蘭素[25]、雙酚A[26]、2，4，6-三氯酚[27]、嗎啡[28]、辛克寧[29]、紅霉素[30]等物質(zhì)的檢測，但對目標(biāo)物質(zhì)的檢測多限于實驗室純水溶液中，而對實際樣品的檢測應(yīng)用較少。薛亞峰等[27]制備了2，4，6-三氯酚傳感器，高敏君等[30]制備了紅霉素傳感器，可用于環(huán)境水樣中目標(biāo)分子的識別; 孟梁等[28]制備的嗎啡傳感器可對吸毒者尿樣中的嗎啡進(jìn)行定性檢測。本研究以滅多威為印跡模板，制備了具有三維大孔結(jié)構(gòu)的分子印跡光子晶體傳感器，并通過光纖光譜儀測試此傳感器在蔬菜基質(zhì)中的響應(yīng)性，實現(xiàn)了復(fù)雜基質(zhì)中滅多威的快速、靈敏檢測。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

USB650光纖光譜儀（美國海洋光學(xué)公司）; S-4800掃描電鏡（日本日立公司）; 高速離心機(jī)（美國賽默飛世爾公司）; JASCO-V630紫外可見分光光度計（日本Jasco公司）; DZF系列真空干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）

滅多威、克百威（98%（w/w），山東華陽科技有限公司）; 甲醇、乙醇、冰乙酸（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）; 氨水（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）; 正硅酸乙酯（TEOS，分析純，天津博迪化工股份有限公司）; 甲基丙烯酸（MAA， 99%（w/w），美國Alfa Aesar化學(xué)有限公司）; 偶氮二異丁腈（AIBN，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）; 乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，99%（w/w），北京百靈威科技有限公司）; 丙烯酰胺（AM，99.9%（w/w），Aladdin公司）; 有機(jī)玻璃（75 mm×25 mm）和載玻片（35 mm×25 mm）均購于本地，載玻片在H2SO4-H2O2（7∶3， V/V）溶液中浸泡12 h，并用去離子水洗凈干燥后待用。實驗用水為去離子水。

2.2?實驗方法

2.2.1?單分散SiO2微球及光子晶體模板的制備?采用改進(jìn)的Stber法制備單分散SiO2微球[31]：在250 mL燒瓶中加入9 mL氨水、16.25 mL無水乙醇和24.75 mL去離子水，1200 r/min磁力攪拌30 min; 將4.5 mL正硅酸乙酯和45.5 mL無水乙醇混合均勻后，快速加入燒瓶中，1 min后將轉(zhuǎn)速調(diào)至450 r/min， 恒溫水浴35℃反應(yīng) 2 h，得到乳白色懸濁液，8000 r/min離心，用無水乙醇重新分散、離心，重復(fù)洗滌3～4次。將得到的SiO2微球在55℃真空干燥箱中烘干，待用。

光子晶體模板采用垂直沉降法[32]自組裝制得。將干燥的SiO2微球超聲分散在無水乙醇中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的懸濁溶液。量取20 mL移入25 mL特制小燒杯中，垂直插入載玻片，放置在恒溫30℃的超凈間內(nèi)，待乙醇揮發(fā)完全后，在載玻片上自組裝形成平整的SiO2光子晶體模板。

2.2.2?滅多威分子印跡光子晶體傳感器的制備?采用模板法[33]制備MIPC。取0.16 g滅多威于5 mL離心管中，加入0.5 mL甲醇、335 μL MAA和0.124 g AM，超聲混合均勻后，于4℃保存過夜，然后再加入282 μL EDMA、0.01 g AIBN，通氮氣10 min除氧，得到聚合溶液。在制備好的光子晶體上覆一片有機(jī)玻璃，用夾子夾住兩端，向夾層中灌入聚合液，直至光子晶體模板的顏色呈透明，然后置于燒杯中，在60℃油浴中聚合4 h。待聚合反應(yīng)完成后，將夾子移除，浸泡在5% HF溶液中，直至載玻片脫落，此時在有機(jī)玻璃上形成了具有三維大孔結(jié)構(gòu)的分子印跡膜。用甲醇-冰乙酸混合液（18∶1，V/V）反復(fù)沖洗有機(jī)玻璃，以除去滅多威分子，直至用紫外分光光度計245 nm波長下在洗脫液中檢測不到滅多威，然后用去離子水沖洗，即得到滅多威分子印跡光子晶體傳感器（MIPC）。將此傳感器保存于去離子水中，待用。非印跡光子晶體（NIPC） 的制備方法除不加滅多威外，其它條件相同。

2.2.3?蔬菜樣品的檢測?白菜樣品購于本地超市。將未檢出滅多威分子的新鮮白菜粉碎，取20 g，加入40 μL 1 g/L 滅多威溶液，制成滅多威含量為2 mg/kg的白菜樣品。取5 g樣品，加入50 mL去離子水，勻漿2 min，用濾紙過濾，得到含量為0.2 mg/L的滅多威白菜基質(zhì)溶液。用同樣方法配制滅多威含量為0.2和0.02 mg/kg白菜樣品，及0.02 和0.002 mg/L的滅多威白菜基質(zhì)溶液。

3?結(jié)果與討論

3.1?滅多威分子印跡光子晶體傳感器的制備及結(jié)構(gòu)表征

滅多威分子印跡光子晶體傳感器的制備如圖1所示，通過垂直沉降自組裝的方法制備光子晶體模板，隨著溶劑的蒸發(fā)，分散在無水乙醇中的SiO2微球在毛細(xì)管作用力和靜電力等作用下整齊地自組裝于玻片上，（MIPC）得到面心立方堆積的三維光子晶體結(jié)構(gòu)。在分子印跡過程中，以滅多威為模板分子，甲基丙烯酸和丙烯酰胺為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸甲酯為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑混合在甲醇溶劑中，甲基丙烯酸與滅多威分子以氫鍵結(jié)合，形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。將聚合液灌入有機(jī)玻璃和光子晶體模板的夾層中進(jìn)行熱聚合，滅多威分子便被固定在凝膠聚合物中，將SiO2微球和模板分子除去后，即得到具有三維大孔結(jié)構(gòu)和特定空穴的滅多威分子印跡光子晶體薄膜。這些薄膜內(nèi)部存在相互連接的大孔，有利于分子的運輸。空穴作為特異性識別位點與目標(biāo)分子結(jié)合，則會引起凝膠的溶脹或收縮。丙烯酰胺作為溶脹性功能單體[34]，有利于印跡聚合物在水溶液中溶脹，吸附印跡分子，縮短響應(yīng)時間。圖2是SiO2光子晶體模板和MIPC的掃描電鏡圖，可見SiO2微球粒徑均一，緊密排列呈六方結(jié)構(gòu)（圖2A），去除SiO2微球后，呈現(xiàn)了三維有序相互連通的大孔結(jié)構(gòu)（圖2B）。

3.2?MIPC的光學(xué)性能表征

MIPC的帶隙中心波長的檢測符合Bragg衍射定律：

其中，λmax為最大衍射峰波長; d為SiO2微球直徑，即MIPC中空腔的直徑; m是布拉格衍射系數(shù)，一般取值為1; D/D0 為MIPC的溶脹率（D和D0分別

表示在一定條件和參考狀態(tài)下處于平衡狀態(tài)的凝膠的直徑）[35]，當(dāng)光子晶體為干片時，該值為1; θ為是入射光與基底法線方向上的夾角，實驗中θ=0°; na為平均折射系數(shù)，ni和fi分別為組成PC或MIPC的各組分的折射率及填充率。由PC和MIPC的反射光譜圖（圖3）可見，MIPC的衍射峰相較于PC發(fā)生了明顯藍(lán)移，這是由于組成兩者的介質(zhì)發(fā)生了改變，由原來的SiO2微球和空氣變成了空氣和凝膠聚合物，導(dǎo)致平均折射系數(shù)變小，表現(xiàn)為光子帶隙發(fā)生藍(lán)移。 此外，在除去模板分子后，MIPC的溶脹率變小也是造成光子帶隙藍(lán)移的一個重要原因。為使MIPC的衍射峰處于可見光范圍，本研究采用直徑為320 nm的SiO2微球。

3.3?MIPC對不同濃度滅多威的響應(yīng)

將制備的MIPC浸入濃度由低到高梯度分布的滅多威溶液中，平衡15 min后，用光纖光譜儀檢測其反射光譜。如圖4A所示，隨著滅多威濃度增加，MIPC的反射峰發(fā)生紅移，當(dāng)滅多威濃度由10?14 g/L增加到10?2 g/L時，反射峰由533 nm紅移到589 nm，移動距離達(dá)56 nm。MIPC在不同濃度的滅多威溶液中的顏色變化見圖4B，隨著滅多威濃度增加，溶液顏色也由綠色逐漸變?yōu)槌燃t色。這是由于滅多威與MIPC中的特異性識別位點結(jié)合，引起凝膠薄膜的溶脹，從而造成晶格參數(shù)增大，根據(jù)Bragg衍射定律，光子晶體的衍射峰會發(fā)生紅移，宏觀表現(xiàn)為表觀顏色的變化。

3.4?MIPC的特異選擇性

研究了NIPC在不同濃度滅多威溶液中光子帶隙的變化情況。如圖5A所示，NIPC的反射峰在滅多威溶液中只有輕微的移動，最大偏移量僅為18 nm，但這種變化沒有規(guī)律性，表明NIPC對滅多威沒有特異性識別能力。同時，考察了MIPC對與滅多威分子結(jié)構(gòu)相似的克百威的響應(yīng)情況，如圖5B所示，MIPC在克百威溶液中光子帶隙最大偏移量為17 nm，這可能是由于少量的克百威分子進(jìn)入凝膠內(nèi)部引起的。對MIPC和NIPC對滅多威和克百威響應(yīng)效果進(jìn)行比較，從圖5C可直觀看出，MIPC對滅多威具有特異吸附性。上述結(jié)果說明，MIPC在多種農(nóng)藥共存時，對目標(biāo)分子滅多威具有高選擇性，能夠滿足對滅多威的檢測要求。

3.5?MIPC在滅多威溶液中的響應(yīng)時間

將制備的MIPC浸入10?4 g/L滅多威溶液中，每隔2 min檢測其反射光譜， 直至反射峰不發(fā)生移動。圖6為MIPC反射峰隨時間的變化譜圖，可見最初的7 min內(nèi)，反射峰移動較大，隨著時間增加， 移動距離逐漸減小，13 min后反射峰不再發(fā)生偏移，表明基本達(dá)到吸附平衡。上述結(jié)果說明，此傳感器具有快速響應(yīng)特性，這是用于凝膠膜內(nèi)具有彼此相互連通的三維多孔結(jié)構(gòu)，有利于目標(biāo)分子的傳輸，減低了傳質(zhì)阻抗，因此響應(yīng)快速。

3.6?MIPC對蔬菜基質(zhì)溶液中滅多威的檢測

考察了制備的MIPC檢測蔬菜基質(zhì)中滅多威殘留的實用性。將制備的MIPC浸入到含不同濃度滅多威的白菜樣品基質(zhì)溶液中，平衡15 min后檢測其反射光譜，結(jié)果見表1。將MIPC浸入滅多威含量0.002、0.02 和0.2 mg/L的白菜樣品基質(zhì)溶液時，MIPC反射峰偏移量分別為28、34和42 nm，表明在復(fù)雜基質(zhì)溶液中，此MIPC保持高選擇性和靈敏度，且對蔬菜中滅多威的檢出限低于國家標(biāo)準(zhǔn)限量值（0.2 mg/kg）[12]的要求，表明此傳感器具有良好的實用性。

4?結(jié) 論

將光子晶體技術(shù)與分子印跡技術(shù)結(jié)合，制備了農(nóng)藥滅多威MIPC傳感材料，考察了其對滅多威和結(jié)構(gòu)相似分子克百威的響應(yīng)性及在實際樣品檢測中的應(yīng)用。結(jié)果表明，制備的MIPC能夠?qū)崿F(xiàn)對滅多威的特異性吸附，響應(yīng)速度快，靈敏度高，可將待測液的濃度信號轉(zhuǎn)化為直觀的顏色信號，實現(xiàn)對目標(biāo)分子的快速檢測。

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