陳佳琦 吳海燕 張旭志 鄭關(guān)超 孫曉杰 郭萌萌 譚志軍 翟毓秀 牟海津

摘?要?以能夠特異性識別大田軟海綿酸（Okadaic acid，OA）的核酸適配體作為識別探針，先利用磁力吸附將核殼型納米金磁微粒（Fe3O4@Au）固定在絲網(wǎng)印刷金電極（Screen-printed gold electrode，SPGE）的表面，然后利用AuS鍵固定核酸適配體，構(gòu)建了可拋式核酸適配體傳感器，用于貝類中OA的高靈敏測定。采用電化學(xué)阻抗譜進(jìn)行測試，利用核酸適配體與OA結(jié)合前后工作電極表面電子傳遞阻抗值的變化量與OA濃度對數(shù)值之間的線性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)貝類中OA的定量檢測。此傳感器制備簡單，采用Fe3O4@Au修飾傳感界面，通過增大工作電極的比表面積提高核酸適配體的組裝量，提高了方法的靈敏度;將核酸適配體作為識別探針，相比抗體的使用大大降低了方法成本;一次性可拋SPGE的應(yīng)用，省去傳統(tǒng)電極使用前必需的繁雜拋光過程。采用此傳感器進(jìn)行貝類中OA的檢測，線性范圍為1～800 μg/kg，檢出限為1 μg/kg;回收率在92.0%～118.6%范圍內(nèi)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.8%～11.6%。本方法簡便高效且重現(xiàn)性良好，可實(shí)現(xiàn)大批量樣品的篩查與定量分析。

關(guān)鍵詞?大田軟海綿酸;核酸適配體傳感器;電化學(xué)阻抗譜;絲網(wǎng)印刷金電極;高靈敏檢測

1?引 言

大田軟海綿酸（Okadaic acid，OA）是腹瀉性貝類毒素（Diarrhetic shellfish poisoning，DSP）的主要致毒組分，由利馬原甲藻及部分鰭藻等產(chǎn)毒微藻產(chǎn)生，經(jīng)雙殼貝類濾食性攝入后富集在消化腺內(nèi)[1]。OA可引發(fā)誤食者惡心、嘔吐、腹瀉;對細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白磷酸酶的活性有強(qiáng)烈的抑制作用[2]，影響正常的細(xì)胞活動(dòng);甚至對人類細(xì)胞具有直接的毒害作用，干擾DNA的修復(fù)過程[3]，改變基因的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤形成[4]。為消除毒素對自身的毒害作用，貝類可通過復(fù)雜的生化反應(yīng)將部分高毒性游離態(tài)的OA轉(zhuǎn)化為形態(tài)各異的低毒性酯化態(tài)衍生物[5]。此外，因OA具有脂溶性和熱穩(wěn)定性，在加工過程中很難通過常見的加工技術(shù)將其去除，甚至可能因貝類脫水及酯化態(tài)毒素向游離態(tài)的轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致毒素的毒性增強(qiáng)[6]。為加強(qiáng)貝類安全的前端防控，歐盟現(xiàn)行法規(guī)規(guī)定雙殼貝類可食性組織中DSP含量不得超過160 μg/kg（以O(shè)A計(jì)）[7]，為進(jìn)一步降低食用風(fēng)險(xiǎn)，歐盟食品安全局根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評估結(jié)果擬將其降低至45 μg/kg[8]。我國國標(biāo)NY 5073-2006規(guī)定其不得檢出[9]。由于倫理道德等原因，歐盟指令（EC）No.15/2011規(guī)定小鼠生物法作為官方標(biāo)準(zhǔn)方法僅限于2014年底前使用，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）作為取代方法，并鼓勵(lì)建立免疫分析等新型檢測方法作為補(bǔ)充方法[10]。

電化學(xué)生物傳感器因其靈敏度高、快速便攜等優(yōu)勢在檢測領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注，核酸適配體也因其能與目標(biāo)物如重金屬離子[11]、毒素[12]、抗生素[13]或病毒[14]等高親和力、高特異性結(jié)合的特點(diǎn)[15]， 在電化學(xué)生物傳感器的研制中得到廣泛應(yīng)用[16]。與傳統(tǒng)電極相比絲網(wǎng)印刷電極（Screen-printed electrode，SPE）具有方便使用、溶液消耗少、三電極體系集成于一體以及使用時(shí)不需額外拋光處理等優(yōu)勢[17， 18]。 同時(shí)， SPE具有用后可拋的特點(diǎn)，避免了因基質(zhì)成分或待測物在電極表面的吸附而造成的電極污染或鈍化現(xiàn)象[19]?；赟PE建立的電化學(xué)生物傳感器具有靈敏穩(wěn)定、易于小型化的優(yōu)勢[20]。

本研究以絲網(wǎng)印刷金電極（Screen-printed gold electrode，SPGE）為基底電極，研制了可拋式核酸適配體傳感器，并引入核殼型納米金磁微粒（Fe3O4@Au）[21]，以提高方法的靈敏度。由于貝類體內(nèi)的OA總量由游離態(tài)毒素及酯化態(tài)衍生物共同組成，而目前的檢測方法通常僅針對游離態(tài)OA進(jìn)行檢測[22，23]，故可能會(huì)因低估毒素的含量而導(dǎo)致食用風(fēng)險(xiǎn)[24]。本方法以自行研制的電化學(xué)生物傳感器為檢測手段，同時(shí)在貝類樣品前處理過程中增加堿性水解步驟，將OA的酯化態(tài)衍生物轉(zhuǎn)化為游離態(tài)OA[25]，實(shí)現(xiàn)了貝類體內(nèi)OA總量的高靈敏檢測。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器、試劑與材料

CHI660D電化學(xué)工作站（上海辰華公司）;T18 basic型均質(zhì)機(jī)（德國IKA 公司）;KQ-300E型超聲波提取儀（昆山市超聲儀器有限公司）;Himac CR 22GⅡ型高速離心機(jī)（日本Hitachi公司）;N-EVAPTM112型氮?dú)獯祾邇x（美國Organomation公司）;Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）;220BT絲網(wǎng)印刷金電極（SPGE，包括金工作電極（Φ=4.0 mm）、對電極和銀參比電極，西班牙DropSens 公司）。

大田軟海綿酸（Okadaic acid，OA）、鰭藻毒素-1（Dinophysistoxin-1，DTX-1），純度≥95%（臺灣Algalchem公司）;鰭藻毒素-2（Dinophysistoxin-2，DTX-2，CRM-DTX2-b，（3.8±0.2） μg/mL）、蛤毒素-2（Pectenotoxin-2，PTX-2，CRM-PTX2-b，（4.4±0.13） μg/mL）、蝦夷扇貝毒素（Yessotoxin，YTX，CRM-YTX-c， 4.3 μmol/L）、DSP陽性貽貝質(zhì)控樣品（CRM-DSP-Mus-c，OA總含量2.4 mg/kg），均購于加拿大國家海洋研究中心;GoldMag納米金磁微粒（Fe3O4@Au，30 nm，5 mg/mL，西安金磁納米生物技術(shù)有限公司）;PBS緩沖液試劑片（Phosphate buffered saline tablet）、 6-巰基-1-己醇（6-Mercapto-1-hexanol，MCH）; K3[Fe（CN）6]、K4[Fe（CN）6]·3H2O、KCl（美國Sigma公司）;甲醇（HPLC級，德國Merck公司）; 5'端巰基修飾核酸適配體（Aptamer，5'-SH C6-GGT CAC CAA CAA CAG GGA GCG CTA CGC GAA GGG TCA ATG TGA CGT CAT GCG GAT GTG TGG-3'）由上海生工生物工程股份有限公司合成;其它未作特殊說明的試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18.2 MΩ· cm）。

實(shí)驗(yàn)所用牡蠣、貽貝和扇貝樣品于2018年7月購自青島市水產(chǎn)品批發(fā)市場，經(jīng)LC-MS/MS方法[26]檢測為OA陰性。樣品洗凈瀝水，去殼勻漿后于20℃冷凍保存。

2.2?溶液的配制

核酸適配體溶液（5 μmol/L）和MCH溶液（1 mmol/L）均由PBS緩沖溶液（10 mmol/L，pH 7.4）配制。OA標(biāo)準(zhǔn)溶液：以PBS緩沖溶液稀釋OA工作液（甲醇配制，1 μg/mL），配制成濃度分別為0.1、0.5、1、5、10、50和80 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。Fe3O4@Au混懸液：使用前用PBS緩沖溶液清洗2次后，稀釋至濃度為1 mg/mL。檢測液用PBS緩沖溶液配制，含5 mmol/L K3[Fe（CN）6]、5 mmol/L K4[Fe（CN）6]和0.1 mol/L KCl。

2.3?樣品的前處理

稱取2 g勻漿樣品，用18 mL甲醇分兩次進(jìn)行毒素提取，渦旋振蕩2 min，8000 r/min離心5 min，合并兩次上清液，以甲醇定容至20 mL。準(zhǔn)確移取1 mL提取液，加入125 μL 2.5 mol/L NaOH混勻后密封，于76℃下孵育40 min。待溶液冷卻至室溫，加入125 μL 2.5 mol/L HCl溶液中和，氮吹近干，再加入1 mL PBS緩沖溶液復(fù)溶，渦旋混勻，待測。

2.4?可拋式電化學(xué)核酸適配體傳感器的構(gòu)建

絲網(wǎng)印刷金電極（SPGE）使用前置于0.5 mol/L H2SO4溶液中進(jìn)行預(yù)處理，在0～1.25 V電位范圍內(nèi)以0.1 V/s速率采用循環(huán)伏安法（Cyclic voltammetry，CV）掃描5 min，以提高傳感界面的粗糙度，利于其功能化修飾[27]。將SPGE用超純水沖洗并吹干后，在其工作電極背面對應(yīng)處固定一個(gè)直徑4 mm的圓形磁鐵，在工作電極表面滴加10 μL 1 mg/mL Fe3O4@Au混懸液，待Fe3O4@Au固定后，滴加10 μL 5 μmol/L核酸適配體溶液，置于濕盒中反應(yīng)過夜。用超純水沖洗后，在工作電極表面滴加10 μL 1 mmol/L MCH溶液反應(yīng)1 h，以封閉多余的吸附位點(diǎn)，即完成傳感器的制備。

2.5?測試方法

在傳感器工作電極表面滴加10 μL OA標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液，反應(yīng)45 min，用超純水沖洗后，在檢測液中進(jìn)行電化學(xué)阻抗譜（Electrochemical impedance spectroscopy，EIS）測試，頻率范圍0.1～10000 Hz，振幅0.01 V，初始電位0.23 V。記錄標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液反應(yīng)前后的阻抗值，進(jìn)行定量分析。

3?結(jié)果與討論

3.1?傳感界面的構(gòu)建及電化學(xué)表征

可拋式核酸適配體傳感器的構(gòu)建及檢測原理如圖1所示。適配體序列參考文獻(xiàn)[28]，在能夠特異性結(jié)合OA的核酸適配體的5'端修飾巰基，通過AuS鍵將核酸適配體直接固定或通過核殼型納米金磁微粒（Fe3O4@Au）固定在傳感界面。無OA存在時(shí)，適配體的空間結(jié)構(gòu)比較松散，阻礙電子在傳感界面的傳遞，導(dǎo)致傳感器阻抗值升高;當(dāng)OA存在時(shí)，與核酸適配體結(jié)合后空間結(jié)構(gòu)變得緊密，為電子的傳遞提供更多的空間，阻抗值下降。根據(jù)傳感器反應(yīng)前后阻抗值的變化量與OA濃度之間的關(guān)系實(shí)現(xiàn)對毒素的定量檢測。

采用CV和EIS對SPGE的修飾過程進(jìn)行表征，CV結(jié)果如圖2A所示，電壓范圍0.3～0.5 V，掃描速率為0.1 V/s。圖2B為電化學(xué)阻抗譜的Nyquist圖，其高頻區(qū)的半圓直徑對應(yīng)電極表面的電子傳遞阻抗Ret。裸電極表面電子可以自由傳遞（Ret=41.06）。核酸適配體的結(jié)合增加了電極表面的傳質(zhì)阻力，

導(dǎo)致Ret值顯著上升（865.90 Ω）;MCH的封閉進(jìn)一步阻礙電子的轉(zhuǎn)移，Ret值繼續(xù)增大（1498 Ω）;當(dāng)OA與核酸適配體特異性結(jié)合后，Ret值下降（1085 Ω），說明二者的結(jié)合促進(jìn)了傳感界面電子的傳遞。這是因?yàn)楹怂徇m配體結(jié)合目標(biāo)物后的空間結(jié)構(gòu)更加緊密，使Ret值降低，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果類似[29，30]。

為提高傳感界面核酸適配體的組裝量，在傳感器的構(gòu)建中引入核殼型納米金磁微粒（Fe3O4@Au）以增大SPGE工作電極的比表面積。當(dāng)未修飾Fe3O4@Au時(shí)，SPGE在核酸適配體固定前后的ΔRet為418.74 Ω，而在修飾Fe3O4@Au后，ΔRet值增至865.90 Ω，表明Fe3O4@Au的引入可提高傳感界面核酸適配體的組裝量。

3.2?實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

3.2.1?核酸適配體濃度的優(yōu)化?傳感界面核酸適配體的組裝量可影響目標(biāo)物的結(jié)合量，進(jìn)而影響方法的檢測性能。對核酸適配體溶液濃度進(jìn)行了優(yōu)化。分別在已固定Fe3O4@Au的傳感界面滴加濃度為1、2、5和10 μmol/L的核酸適配體溶液，反應(yīng)過夜后，進(jìn)行EIS測試。如圖3所示，隨著適配體濃度的增大，ΔRet隨之增大，當(dāng)適配體濃度為5 μmol/L時(shí)，ΔRet達(dá)到最大值，隨后趨于穩(wěn)定，表明核酸適配體的結(jié)合量已達(dá)到飽和。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用5 μmol/L核酸適配體溶液進(jìn)行電極組裝。

3.2.2?目標(biāo)物孵育時(shí)間的優(yōu)化?目標(biāo)物的孵育時(shí)間也是影響核酸適配體傳感器性能的因素之一?？疾炝瞬煌跤龝r(shí)間時(shí)，傳感器與OA結(jié)合前后的ΔRet值。如圖4所示，隨著孵育時(shí)間的延長，ΔRet增大，當(dāng)時(shí)間達(dá)到45 min以后，ΔRet趨向平穩(wěn)，因此選擇45 min作為孵育時(shí)間。

3.3?傳感器的分析性能

測定不同濃度的OA標(biāo)準(zhǔn)溶液在適配體傳感器上的阻抗響應(yīng)值，以O(shè)A與電極反應(yīng)前后ΔRet值為縱坐標(biāo)， OA溶液濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖5可見，ΔRet與OA濃度（0.1～80 ng/mL）對數(shù)值呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y=189.12lnx+752.59（R2=0.9976），檢出限為0.1 μg/L（S/N=3），空白樣品基質(zhì)與PBS緩沖溶液的響應(yīng)相當(dāng)，表明貝類基質(zhì)對傳感器測定基本無干擾，應(yīng)用于實(shí)際貝類樣品檢測時(shí)最低檢出濃度為1 μg/kg， 與LC-MS/MS方法[26]相比降低了一個(gè)數(shù)量級，定量范圍為1～800 μg/kg。而傳感界面無Fe3O4@Au修飾時(shí)，傳感器的線性范圍為5～500 μg/kg，實(shí)際檢測時(shí)的最低檢出濃度為5 μg/kg。上述結(jié)果表明，傳感器構(gòu)建過程中Fe3O4@Au的引入可顯著提高檢測方法的靈敏度，并擴(kuò)大了線性范圍。