魏佳 高嘉雪 王瑤琪 王振新 孟憲瑛

摘?要?研發(fā)了一種基于DNA芯片（DNA microarray）的熒光分析方法， 并將其用于檢測(cè)甲狀腺乳頭癌相關(guān)的BRAFV600突變。本方法采用三鏈雜交體系， 首先將單鏈DNA（ssDNA）捕獲探針固定在微陣列芯片基底上，制備DNA芯片;以其為反應(yīng)平臺(tái)， 加入ssDNA目標(biāo)物與ssDNA捕獲探針進(jìn)行雜交;最后加入熒光分子Cy5的修飾ssDNA標(biāo)記ssDNA目標(biāo)物， 檢測(cè)熒光信號(hào)。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下， 本方法對(duì)BRAFV600E突變型ssDNA目標(biāo)物的檢測(cè)靈敏度達(dá)到亞納摩爾級(jí)（0.25 nmol/L）， 且具有3個(gè)數(shù)量級(jí)的線性范圍， 并能夠從突變型ssDNA目標(biāo)物和野生型ssDNA目標(biāo)物的混合物中區(qū)分出低至0.1%的BRAFV600E突變型ssDNA目標(biāo)物。利用本方法對(duì)15例臨床甲狀腺組織樣本的BRAFV600E突變水平進(jìn)行了分析， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與常規(guī)Sanger測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果一致， 表明本方法具有良好的實(shí)用性。

關(guān)鍵詞?甲狀腺乳頭狀癌; BRAFV600E突變; DNA芯片

1?引 言

BRAF基因（B-Rapidly accelerated fibrosarcoma proto-oncogene）在黑色素瘤、甲狀腺癌等多種人類癌癥中均具有發(fā)生突變的傾向， 被認(rèn)為是相關(guān)癌癥的主要治療靶點(diǎn)[1～4]。自第一個(gè)致癌的BRAF突變?cè)?1世紀(jì)初被證實(shí)后， 科研究人員又相繼發(fā)現(xiàn)多種過度活化的BRAF致癌突變（包括BRAFV600E、BRAFV600A和BRAFV600G）[5，6]。其中， BRAFV600E突變（纈氨酸（V）單位點(diǎn)突變?yōu)楣劝彼幔‥））占BRAF致癌突變的90%。研究表明， BRAFV600E選擇性抑制劑療法可有效延長(zhǎng)BRAFV600E突變患者的總生存期[1，2]。

由于BRAFV600E突變?cè)诟鞣N癌癥中廣泛存在， 對(duì)BRAFV600E突變水平的高靈敏度和高選擇性分析對(duì)于腫瘤患者的診斷、治療和預(yù)后具有重要意義[3～5]。 Sanger測(cè)序[6]、微陣列芯片[7]、結(jié)合等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)的熔融曲線分析[8，9]、免疫組化[10，11]和光學(xué)生物傳感器[12，13]等技術(shù)均能實(shí)現(xiàn)BRAF突變的定性與定量分析[14～18]。其中， 微陣列芯片僅需使用極少的樣品量即可獲得高通量的全基因組突變或單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism， SNP）分析結(jié)果， 且一張微陣列芯片可同時(shí)分析多個(gè)樣本， 極大地節(jié)省了實(shí)驗(yàn)時(shí)間和成本。例如， 科研人員使用微陣列芯片從黑色素瘤樣本中成功區(qū)分出BRAF突變型和野生型樣本[7，17，18]。然而， 由于缺乏靈敏度和選擇性， 利用微陣列芯片檢測(cè)手術(shù)切除或活體檢查的癌組織樣本中較低等位基因頻率（<5%）的BRAFV600E突變卻少有報(bào)道。近三十多年， 中國(guó)甲狀腺癌的發(fā)病率不斷增加， 其中， 甲狀腺乳頭狀癌（Papillary thyroid cancer， PTC）占甲狀腺癌病例的85%以上[19]， 且在25%～45%的甲狀腺癌患者中存在BRAF突變[20，21]。另外， BRAFV600E突變是PTC的惡性程度和預(yù)后重要指標(biāo)， 即BRAFV600E突變?yōu)殛?yáng)性與患者死亡密切相關(guān)[22]。

本研究通過改變ssDNA捕獲探針上突變位點(diǎn)的位置， 對(duì)不同BRAFV600E的突變位點(diǎn)進(jìn)行了優(yōu)化。同時(shí)， 結(jié)合不對(duì)稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction， PCR）擴(kuò)增策略， 制備了具有高選擇性和高靈敏度的DNA微陣列芯片（簡(jiǎn)稱DNA芯片， DNA microarray）， 用于檢測(cè)BRAFV600E突變， 并成功用于檢測(cè)通過手術(shù)切除的PTC組織樣本中BRAFV600E的突變水平。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

晶芯SmartArrayer 136微陣列芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)、晶芯LuxScan 10K微陣列芯片掃描儀、高分子三維基片D、聚四氟乙烯網(wǎng)格圍欄（北京博奧生物有限公司）; TC-5000梯度PCR儀（英國(guó)Techne公司）; 5415R型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）; HPC-250CL恒溫恒濕箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）。

實(shí)驗(yàn)中所使用的單鏈寡核苷酸（ssDNA）序列（上海生工生物工程股份有限公司合成）如表1所示; 組織基因組DNA提取試劑盒、多功能DNA純化及回收試劑盒（百泰克公司）; 十二烷基硫酸鈉、檸檬酸鈉緩沖液、甲醛溶液（阿拉丁公司）; OneTaq熱啟動(dòng)DNA聚合酶2×預(yù)混液（美國(guó)NEB公司）。其它化合物均為分析純， 購(gòu)于北京化工廠。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q（美國(guó)Millipore公司）制備的超純水（18.2 MΩ cm）。

2.2?臨床組織樣品的制備

甲狀腺組織標(biāo)本取自吉林大學(xué)第一醫(yī)院甲狀腺外科行甲狀腺手術(shù)的PTC患者， 已征得患者同意。采用組織基因組DNA提取試劑盒提取樣本DNA， 并作為不對(duì)稱重疊擴(kuò)增PCR實(shí)驗(yàn)的模板， 通過兩個(gè)獨(dú)立的PCR步驟擴(kuò)增基因組DNA。具體操作如下：將10 μL oneTaq熱啟動(dòng)DNA聚合酶2×預(yù)混液、1 μL F1、1 μL R1、1 μL模板DNA混合， 加水至20 μL， 在TC-5000擴(kuò)增儀上進(jìn)行兩步擴(kuò)增， 擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性3 min后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)（94℃解鏈30 s， 47℃退火20 s， 68℃引物延伸20 s）， 68℃延伸5 min， 迅速降溫至4℃; 將此雙鏈的反應(yīng)產(chǎn)物作為第二步PCR的模板， 擴(kuò)增出單鏈的ssDNA， 將25 μL oneTaq熱啟動(dòng)DNA聚合酶2×預(yù)混液、2.5 μL F1、2.5 μL模板（此模板中包含第一步反應(yīng)中剩余的少許部分R1）混合， 加水至50 μL， 反應(yīng)步驟與第一步相同。經(jīng)過第二步不對(duì)稱PCR后， 采用多功能DNA純化及回收試劑盒對(duì)獲得的粗品進(jìn)行純化。用雜交緩沖液稀釋純化后所得產(chǎn)物， 直接進(jìn)行SNP分析。

2.3?DNA芯片的制備

本實(shí)驗(yàn)中共設(shè)計(jì)了12種針對(duì)BRAFV600E不同突變位點(diǎn)的氨基修飾的ssDNA捕獲探針（Probe 1E、3E、5E、7E、9E、1W、3W、5W、7W、9W、7A、7G， 如表1所示）， 將不同濃度的ssDNA捕獲探針溶解于點(diǎn)樣緩沖液中（3×SSC、0.1% （w/V） SDS和1.5 mol/L甜菜堿）， 采用接觸法在醛基修飾的三維高分子D基片上進(jìn)行點(diǎn)樣。點(diǎn)樣后將微陣列芯片置于溫度為37℃， 濕度為75%的恒溫恒濕箱中孵育12 h， 再依次用清洗緩沖液（1×SSC， 0.01% （w/V） SDS， 30 mL）和水各清洗3次。隨后將微陣列芯片置于含0.1 mol/L乙醇胺的PBS（pH 7.5， 50 mmol/L PB， 0.15 mol/L NaCl）中，在30℃下孵育1 h， 以封閉芯片表面未反應(yīng)的醛基。最后， 用PBS和水各洗滌3次， 離心（480 r/min， 1 min）甩干， 并用聚四氟乙烯圍欄將所制備的微陣列芯片分成12個(gè)獨(dú)立的子陣列， 得到DNA芯片。

2.4?BRAFV600E突變DNA的檢測(cè)

將模擬樣本（合成的4種ssDNA目標(biāo)物（Target E、W、G、A）及其混合物）和純化后的不對(duì)稱PCR產(chǎn)物分別溶解在雜交緩沖液（3×SSC， 0.1% （w/V） SDS）中， 將30 μL上述溶液分別加入到每個(gè)子陣列中， 44℃下雜交2 h， 按照以下步驟進(jìn)行清洗：30 mL雜交緩沖液37℃下清洗3次， 5 min/次， 30 mL清洗緩沖液25℃下清洗3次， 5 min/次， 30 mL水4 ℃下清洗3次， 3 min/次， 離心甩干后， 再向每個(gè)子陣列中加入30 μL 200 nmol/L溶解在標(biāo)記緩沖液（1×SSC， 0.1%（w/V）SDS）中的Cy5修飾的標(biāo)記ssDNA（Label）， 并在30℃孵育1 h， 按照如上所述的步驟洗滌和干燥后， 使用芯片掃描儀提取陣列點(diǎn)的熒光信號(hào)值。相對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)度（F）定義如下：F=Fsample/Fblank， 其中Fsample為樣品的熒光信號(hào)強(qiáng)度， Fblank為空白樣品的熒光信號(hào)強(qiáng)度， 采用不含ssDNA目標(biāo)物的雜交緩沖液作為空白樣品。熒光信號(hào)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差均由6個(gè)重復(fù)信號(hào)點(diǎn)的信號(hào)值計(jì)算得到。

3?結(jié)果與討論

3.1?DNA芯片反應(yīng)條件的優(yōu)化

構(gòu)建的DNA芯片熒光檢測(cè)方法的原理如圖1所示。氨基修飾的ssDNA捕獲探針通過席夫堿反應(yīng)固定于醛基修飾的芯片基底; 一部分ssDNA目標(biāo)物與ssDNA捕獲探針進(jìn)行雜交， 另一部分與Cy5標(biāo)記的ssDNA完成雜交， 以獲得熒光檢測(cè)信號(hào)。Cy5具有較好的光穩(wěn)定性和較高的量子產(chǎn)率（0.28）， 有助于提高檢測(cè)靈敏度。

首先考察了ssDNA捕獲探針突變位點(diǎn)位置對(duì)ssDNA目標(biāo)物雜交效率和選擇性的影響。ssDNA捕獲探針包含25個(gè)核苷酸， 包括間隔區(qū)（T10）和與相應(yīng)的ssDNA目標(biāo)物雜交的ssDNA片段。BRAFV600E突變位點(diǎn)位于捕獲探針5'末端開始的的第1、3、5、7、9位。其中， 捕獲探針Probe 1E、3E、5E、7E或9E與BRAFV600E突變型ssDNA目標(biāo)物Target E完全互補(bǔ)， 而捕獲探針Probe 1W、3W、5W、7W或9W與野生型ssDNA目標(biāo)物Target W完全互補(bǔ)。如圖2所示， ssDNA捕獲探針上突變位點(diǎn)的位置對(duì)ssDNA目標(biāo)物雜交效率和選擇性有極大影響。除了Probe 5E和5W， 隨著BRAFV600E突變位點(diǎn)距探針5'末端距離的增大， 與之雜交的ssDNA目標(biāo)物5'端游離出的ssDNA片段隨之增加， 空間位阻增大， 從而使雜交效率降低， F逐漸降低。然而， 完全互補(bǔ)雙鏈DNA（dsDNA）與單堿基錯(cuò)配dsDNA的F比值卻不斷增加， 即檢測(cè)的靈敏度降低而選擇性變好。dsDNA的熔點(diǎn)溫度與其序列密切相關(guān)， 相對(duì)于其它dsDNA， 突變位點(diǎn)位于位置5的dsDNA熔點(diǎn)溫度較低。該現(xiàn)象導(dǎo)致在相同的雜交溫度下， Probe 5E和Probe 5W與相應(yīng)的ssDNA目標(biāo)物雜交效率較低， 檢測(cè)信號(hào)較弱。綜合考慮檢測(cè)靈敏度和選擇性， 在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用突變位點(diǎn)位于位置7的捕獲探針（Probe 7E和Probe 7W）檢測(cè)ssDNA目標(biāo)物。

由于每個(gè)dsDNA都具有其特定的熔點(diǎn)溫度， 因此， 雜交效率會(huì)受到雜交溫度的影響。過低的雜交溫度不能完全消除DNA目標(biāo)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)， 而過高的雜交溫度可能導(dǎo)致dsDNA的雙螺旋解旋。 如圖3所示， F受雜交溫度影響很大。在44℃雜交溫度下， 完全互補(bǔ)dsDNA的F最大， 表現(xiàn)出較高的雜交效率。因此， 選擇44℃為最佳雜交溫度。

3.2?模擬樣本中BRAFV600E突變的檢測(cè)

為了考察該DNA芯片對(duì)BRAFV600E突變檢測(cè)的選擇性， 將4種ssDNA目標(biāo)物（包含1種野生型Target W和3種突變型Target E、G和A）分別與4種ssDNA捕獲探針修飾的芯片共同孵育。通過雜交形成4個(gè)完全互補(bǔ)的dsDNA和12個(gè)單堿基錯(cuò)配的dsDNA。4個(gè)完全互補(bǔ)的dsDNA分別代表野生型BRAFV600（wild-type）、具有A等位基因的BRAFV600（BRAFV600E突變）、具有C等位基因的BRAFV600（BRAFV600A突變）和具有G等位基因的BRAFV600（BRAFV600G突變）基因組DNA。如圖4所示， 完全互補(bǔ)的dsDNA均表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光信號(hào)。其中， 具有BRAFV600E突變的完全互補(bǔ)dsDNA的熒光信號(hào)比其它對(duì)應(yīng)單堿基錯(cuò)配dsDNA的熒光信號(hào)高13倍以上（圖4A）。以上結(jié)果表明， 構(gòu)建的基于DNA芯片熒光檢測(cè)方法具有良好的選擇性，

增加而線性增大， 檢出限（3σ）為0.25 nmol/L。與其它SNP檢測(cè)方法（如電化學(xué)生物傳感器[23]、表面聲波生物傳感器[24]、微懸臂生物傳感器[25]等）相比， 本方法具有較低的檢出限， 能夠滿足臨床實(shí)際樣品的檢測(cè)需求。等位基因頻率的定量分析在疾病診斷方面具有重要意義， 本研究在保持模擬樣本中ssDNA目標(biāo)物總量不變的條件下， 改變Target E和Target W的比例， 考察本方法對(duì)等位基因頻率的測(cè)定能力。如圖6所示， 對(duì)于總量為3 pmol的混合ssDNA目標(biāo)物， 最低可檢出豐度為0.1%的Target E（F大于空白樣品σ）， 優(yōu)于文獻(xiàn)[8]報(bào)道的方法。以上結(jié)果表明， 基于DNA芯片的熒光分析方法可用于靈敏、特異地分析復(fù)雜樣品中的BRAFV600E突變。

3.3?實(shí)際樣本中BRAFV600E突變的檢測(cè)

為了考察本方法的實(shí)用性， 對(duì)4名良性甲狀腺結(jié)節(jié)（BTN）患者和11名PTC患者臨床樣本甲狀腺組織中的BRAFV600E突變水平進(jìn)行了分析。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下， 對(duì)組織提取的基因組DNA的不對(duì)稱PCR產(chǎn)物進(jìn)行了檢測(cè)。與100 ng/mL不對(duì)稱PCR產(chǎn)物雜交， 并使用Label標(biāo)記后， 通過計(jì)算Probe 7E陣列點(diǎn)的平均熒光信號(hào)強(qiáng)度與Probe 7W陣列點(diǎn)的平均熒光信號(hào)強(qiáng)度的比值表示BRAFV600E突變水平。如圖7所示， 約50%的PTC組織表現(xiàn)出較高的BRAFV600E突變等位基因頻率水平（>20%）， 而BTN組織則表現(xiàn)出相對(duì)較低的BRAFV600E突變的等位基因頻率水平（<15%）。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與商業(yè)化Sanger測(cè)序法的檢測(cè)結(jié)果高度一致（約80%）。此外， 本方法可檢測(cè)低至100 ng/mL的PCR產(chǎn)物， 遠(yuǎn)低于Sanger測(cè)序法的檢出限（20 μg/mL）。

4?結(jié) 論

建立了基于DNA芯片的熒光分析方法， 通過優(yōu)化DNA捕獲探針的序列和雜交溫度， 選擇性地檢測(cè)BRAFV600E突變。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下， 本方法能夠區(qū)分野生型BRAFV600和3種BRAFV600突變， 且對(duì)BRAFV600E突變等位基因的檢出頻率低至0.1%。此外， 本方法對(duì)15名臨床患者甲狀腺組織樣本中BRAFV600E突變水平的檢測(cè)結(jié)果與商業(yè)化Sanger測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)。結(jié)合不對(duì)稱PCR擴(kuò)增策略， 本方法在檢測(cè)不同臨床樣品中的BRAFV600E突變方面具有很大的潛力， 為甲狀腺癌的治療或預(yù)后提供了一種新方法。

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