曾海生 陳勇 謝臻

摘要：采用HPLC法測(cè)定清蒸大黃中的5種游離蒽醌的含量。色譜柱為T(mén)hermo BDS HYPERSII C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇-0.1%磷酸（76∶24）水溶液為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果表明，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚分別在0.020 7～0.414 0 μg（R2=0.999 9）、0.172 1～3.442 0 μg（R2=0.999 6）、0.020 3～0.406 0 μg（R2=0.999 9）、0.148 0～2.960 0 μg（R2=0.999 8）、0.164 0～3.280 0 μg（R2=0.999 3）的線性范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，說(shuō)明該方法可作為大黃及其不同炮制品的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞：清蒸大黃;游離蒽醌;炮制;高效液相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.7+2? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）07-0111-04

大黃屬中藥瀉下藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歷代本草均有收載。大黃為蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatum L.）、唐古特大黃（Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.）或藥用大黃（Rheum officinale Baill.）的干燥根和根莖[1]。掌葉大黃和唐古特大黃被稱(chēng)為北大黃，主產(chǎn)于青海和甘肅等地;藥用大黃稱(chēng)為南大黃，主產(chǎn)于四川、陜西等地[2]。中國(guó)有大黃45個(gè)品種和2個(gè)亞種，但2015版《中國(guó)藥典》只收錄3種大黃，即正品大黃、唐古特大黃和藥用大黃的干燥根及根莖，主要有效成分有蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、沒(méi)食子酸、番瀉苷類(lèi)、鞣質(zhì)、大黃多糖和微量元素等[3，4]。大黃性苦、寒，歸脾、胃、大腸、心、肝經(jīng)，藥理作用廣泛，如瀉下、消炎、抗菌、抗病毒、利膽、止血、降血脂、降血壓等[5，6]。

除了使用生品外，也常使用炮制品，根據(jù)醫(yī)院臨床用藥的需要，大黃需炮制成不同炮制品。大黃含有多種有效成分，在加熱蒸炒炮制過(guò)程中，其所含有效成分含量變化很大，藥理藥效隨之發(fā)生變化。根據(jù)辨證施治的需要，合理選用不同的炮制品，才能提高中醫(yī)用藥的療效，避免產(chǎn)生毒副作用[7-10]。試驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定清蒸大黃中5種游離蒽醌成分，為綜合評(píng)價(jià)清蒸大黃的藥材質(zhì)量提供方法。

1? 材料與方法

1.1? 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀，包括2489UV、四元泵、真空脫氣泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和Empower3液相工作站;PRACTUM224-KNSOP電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司];HWS-26電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）。

1.2? 試劑

甲醇，色譜純（美國(guó)Fisher科學(xué)世界公司）;甲醇、乙醇，分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;醋酸鎂（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;磷酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;超純水，其他試劑均為分析純。蘆薈大黃素（批號(hào)：160520）、大黃酸（批號(hào)：170219）、大黃素（批號(hào)：170224）、大黃酚（批號(hào)：160124）、大黃素甲醚（批號(hào)：160602），純度>98%，均購(gòu)于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。

1.3? 方法

1.3.1? 清蒸大黃? 取洗凈生大黃片放入蒸制容器內(nèi)，置水鍋上，加熱蒸約4 h，表面顯微黑棕色，取出[11，12]，曬干或烘干（圖1）。

1.3.2? 色譜條件? Thermo BDS HYPERSIIC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸（76∶24），檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.3? 對(duì)照品溶液制備? 分別精密稱(chēng)取蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚12.94、 12.69、14.34、12.33、13.67 mg，加入甲醇溶解，蘆薈大黃素和大黃素分別定容至25 mL容量瓶中，大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚分別定容至10 mL容量瓶中，即得各對(duì)照品儲(chǔ)備液。

分別精密量取蘆薈大黃素和大黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚對(duì)照品儲(chǔ)備液3 mL，置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，即得混合對(duì)照品溶液，即蘆薈大黃素20.70 μg/mL，大黃酸172.08 μg/mL，大黃素20.30 μg/mL，大黃酚147.96 μg/mL，大黃素甲醚164.04 μg/mL。

1.3.4? 供試品制備? 取清蒸大黃粉末約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加人甲醇25 mL，稱(chēng)定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 色譜條件

按照“1.3.2”色譜條件，各組分分離度良好（圖2）。

2.2? 線性關(guān)系考察

分別精密吸取大黃混合對(duì)照品溶液1、2、5、8、12、15、20 μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，分別以峰面積和進(jìn)樣量（μg）為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。精密吸取上述大黃混合對(duì)照品稀釋液進(jìn)樣，測(cè)定其信號(hào)（以峰高計(jì)算）與噪聲比值，將S/N=3時(shí)的濃度定為檢測(cè)限（LOD），將S/N=10時(shí)的濃度定為定量限（LOQ）。各組分在各自的含量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（表1）。

2.3? 方法學(xué)考察

2.3.1? 精密度試驗(yàn)? 精密量取混合對(duì)照品溶液適量，按“1.3.2”條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄各自的峰面積，并計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD。結(jié)果測(cè)得混合對(duì)照品中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD值分別為0.70%、0.70%、0.37%、0.35%和0.42%，RSD都小于3.0%，表明所用液相色譜儀的精密度較好。

2.3.2? 穩(wěn)定性試驗(yàn)? 取清蒸大黃粉末0.5 g，按“1.3.4”方法制備清蒸大黃供試品溶液，分別于供試品溶液制備后0、2、4、8、12、24 h，按“1.3.2”條件依次測(cè)定各供試品的峰面積，結(jié)果測(cè)得清蒸大黃中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.36%、0.39%、0.46%、0.25%、0.24%，其RSD值均小于3.0%，說(shuō)明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.3? 重復(fù)性試驗(yàn)? 精密稱(chēng)取清蒸大黃藥材粉末6份，各0.5 g，按“1.3.4”方法制備清蒸大黃供試品溶液，按“1.3.2”條件依次測(cè)定各供試品的峰面積，計(jì)算大黃不同炮制品中蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚平均含量，結(jié)果測(cè)得其含量分別為0.941 2、2.230 7、1.512 0、3.206 7、4.063 4 mg，其RSD值均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4? 加樣回收率試驗(yàn)? 精密稱(chēng)取清蒸大黃藥材粉末9份，各0.25 g，分成3組，即低、中、高加樣組，每組分別加入混合對(duì)照品溶液（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚），按“1.3.4”方法制備清蒸大黃供試品溶液，按“1.3.2”條件測(cè)定，計(jì)算清蒸大黃低、中、高加樣組中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率及其RSD值，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，該方法準(zhǔn)確性良好。

2.4? 樣品含量測(cè)定

稱(chēng)取清蒸大黃藥材粉末（過(guò)2號(hào)篩）0.5 g，3份，按“1.3.4”方法制備成供試品溶液，按“1.3.2”條件測(cè)定，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3? 討論

3.1? 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)采用HPLC測(cè)定大黃游離蒽醌類(lèi)成分，對(duì)其流動(dòng)相進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相中加入不同種類(lèi)的酸對(duì)5種游離蒽醌的分離有較大影響。本試驗(yàn)采用甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.1%冰醋酸溶液、甲醇-0.2%冰醋酸溶液和甲醇-0.1%冰醋酸溶液等流動(dòng)相進(jìn)行比較，結(jié)果表明，甲醇-0.1%磷酸溶液（76∶24）作為流動(dòng)相，5種游離蒽醌分離效果較好，與雜峰達(dá)到基線分離。

3.2? 炮制品與其對(duì)應(yīng)的藥理相關(guān)性分析

在蒸制的過(guò)程中，蒸氣加熱，溫度高，破壞了主要瀉下成分的結(jié)合型大黃酸，使其瀉下作用下降;? 而大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量的增加，抑制血小板凝集作用，降低血小板活性，凝集狀態(tài)得到改善，滲透壓趨于正常。因此，清蒸大黃相對(duì)于生大黃來(lái)說(shuō)，活血祛瘀的功效更好。生大黃經(jīng)炮制后，其藥效發(fā)生了改變，治療范圍擴(kuò)大[13-15]。同時(shí)，經(jīng)過(guò)蒸制，清蒸大黃對(duì)胃腸道刺激較生大黃有所下降。不同的中藥炮制方法產(chǎn)生不同的炮制品，其治療效果也會(huì)產(chǎn)生差異，所以臨床上要辨證施治。

參考文獻(xiàn)：

[1] 康延國(guó).中藥鑒定學(xué)[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2012.72-73.

[2] 黃兆勝.中藥學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2002.137.

[3] 容悅瑩，馮素香，吳純偉，等.大黃化學(xué)成分的藥動(dòng)學(xué)及其代謝的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016（10）：199-203.

[4] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[5] 傅興圣，陳? 菲，劉訓(xùn)紅，等.大黃化學(xué)成分與藥理作用研究新進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志，2011（16）：1534-1538，1568.

[6] 范妙漩，趙海譽(yù)，王一濤，等.中藥大黃現(xiàn)代藥理學(xué)研究與中西醫(yī)結(jié)合的應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2009（4）：7-8.

[7] 魏江存，陳? 勇，謝? 臻，等.紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定生大黃和醋大黃的總蒽醌含量[J].井岡山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2017，38（6）：88-92.

[8] 魏江存，陳? 勇，謝? 臻，等.中藥大黃炮制品的化學(xué)成分及藥效研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2017，28（25）：3569-3574.

[9] 魏江存，陳? 勇，謝? 臻，等.紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)大黃不同炮制品總蒽醌含量[J].廣州化工，2017，45（17）：126-128.

[10] 魏江存，陳? 勇，庾延和，等.中藥復(fù)方安全性因素的研究分析[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2016，25（23）：115-118.

[11] 夏從龍.不同大黃炮制品的制作方法及臨床應(yīng)用[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2001（9）：797.

[12] 肖井雷，劉玉翠，劉媛媛，等.熟大黃炮制工藝優(yōu)選及判定標(biāo)準(zhǔn)量化研究[J].中草藥，2017，48（8）：1571-1576.

[13] 鐘厚舉.大黃不同制品的炮制方法及臨床應(yīng)用[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2004（7）：409.

[14] 祝婷婷，劉? 曉，汪小莉，等.大黃不同方法炮制后藥理作用及化學(xué)成分變化研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志，2016，25（8）：883-887.

[15] 李? 麗.大黃炮制前后物質(zhì)基礎(chǔ)變化規(guī)律研究[D].北京：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，2011.