蔡萌 張文婷 汪最

摘要：試驗(yàn)選取厚樸酚、黃藤素、秦皮、大黃素和黃柏5種中藥提取物，采用藥敏紙片法和布氏肉湯稀釋法對(duì)禽多殺性巴氏桿菌C48-1進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，厚樸酚、黃藤素和秦皮提取物的抑菌圈大小分別為22.0、11.3、15.6 mm，最小抑菌濃度（MIC）分別為8、256、64 μg/mL，最小殺菌濃度（MBC）分別為16、512、256 μg/mL;大黃素和黃柏提取物對(duì)C48-1沒(méi)有抑菌作用;厚樸酚的抑菌作用最強(qiáng)，秦皮次之，黃藤素最弱。培養(yǎng)禽多殺性巴氏桿菌C48-1時(shí)，培養(yǎng)基中加入厚樸酚含量為6 μg/mL時(shí)，細(xì)菌的生長(zhǎng)速度相比對(duì)照組受到明顯抑制，當(dāng)藥物濃度為MIC（8 μg/mL）值時(shí)，禽多殺性巴氏桿菌C48-1生長(zhǎng)被完全抑制。從體內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果可知，厚樸酚對(duì)禽多殺性巴氏桿菌C48-1侵染江漢雞的保護(hù)力最高，為50%。該結(jié)果為進(jìn)一步研制中藥制劑預(yù)防禽多殺性巴氏桿菌病提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：中藥提取物;禽多殺性巴氏桿菌;抑菌作用

中圖分類號(hào)：S859.3;R282.71? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）07-0089-03

Abstract： The experiment was conducted to explore the inhibition effect of magnolol，palmatine，cortex fraxini，emodin and cortex phellodendri on avian Pasteurella multocida C48-1 determined by disk diffusion method and double dilution method. The results of vitro antibacterial effect indicated that the diameter of inhibition zone of magnolol，palmatine，cortex fraxini were 22.0，11.3，15.6 mm，and the MIC were 8，256，64 μg/mL，and the MBC were 16，512，256 μg/mL，respectively. Emodin and cortex phellodendri had no antibacterial effect on P.multocida C48-1. Magnolol had the strongest antibacterial effect， followed by cortex fraxini，and palmatine had the weakest antibacterial effect on P.multocida C48-1. When P.multocida C48-1 were cultured in the content that magnolol was 6 μg/mL，the growth rate was significantly inhibited compared with the control group. P.multocida C48-1 wont be completely inhibited until the magnolols content reached 8 μg/mL. According to the results of vivo antibacterial effect， the protective rate of magnolol was up to 50% when Jianghan chickens was infected by P. multocida C48-1. This study also provides an important basis for further studying to protect avian P. multocida disease.

Key words： extracts of traditional Chinese medicine; avian Pasteurella multocida; antibacterial effect

禽多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）為無(wú)芽孢、不運(yùn)動(dòng)、兼性厭氧、菌體兩端常染色濃重的革蘭氏陰性小桿菌[1]。在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中，禽多殺性巴氏桿菌可使雞發(fā)生禽霍亂，導(dǎo)致養(yǎng)殖戶嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前主要采用抗生素防治禽多殺性巴氏桿菌，但抗菌藥物的不合理應(yīng)用，特別是將抗菌藥物作為抗菌生長(zhǎng)促進(jìn)劑添加到飼料中，使巴氏桿菌表現(xiàn)為耐藥率高、耐藥范圍廣、呈多重耐藥等特點(diǎn)，而且加劇了抗生素在動(dòng)物體內(nèi)的殘留，嚴(yán)重危害了動(dòng)物食品安全[3，4]。中藥具有抗菌消炎、無(wú)殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。中藥的使用可以降低抗生素類藥物殘留，減少耐藥性[5]。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，未見(jiàn)有對(duì)禽多殺性巴氏桿菌有較好抑菌效果和保護(hù)效果的中藥。

試驗(yàn)采用藥敏紙片法、微量肉湯稀釋法對(duì)厚樸酚、黃藤素、大黃素、秦皮和黃柏等中藥提取物對(duì)禽多殺性巴氏桿菌C48-1的體外抑菌作用進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)抑菌效果較好的厚樸酚進(jìn)行體內(nèi)抑菌試驗(yàn)，旨在找到有較強(qiáng)抑菌作用、能夠防治禽霍亂的中草藥制劑。

1? 材料與方法

1.1? 菌株與主要試劑

禽多殺性巴氏桿菌（C48-1）菌株購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，TSA、TSB培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司，MH肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司，聚乙二醇400購(gòu)自索萊寶科技有限公司，厚樸酚、秦皮、黃藤素、大黃素和黃柏提取物由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所提供。

1.2? 主要儀器設(shè)備

37 ℃恒溫培養(yǎng)箱（黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司），微量紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)（NanoDropTMOneC），超聲波清洗機(jī)（墨潔S3000），精密分析天平。

1.3? 中藥藥液的制備

將中藥稱量少許溶于50% PEG400中，用超聲波振蕩助溶，再用0.22 μm濾膜過(guò)濾，使藥液濃度相當(dāng)于4 096 μg/mL，4 ℃保存，備用。

1.4? 單味中藥提取物抑菌圈直徑的測(cè)定

將濾紙片用直徑6 mm打孔器打成圓片，120 ℃干熱滅菌2 h。在無(wú)菌條件下，將紙片放入中藥藥液中，室溫浸泡2 h，用培養(yǎng)皿干燥法干燥，4 ℃保存?zhèn)溆?。以MH培養(yǎng)基培養(yǎng)新鮮的禽多殺性巴氏桿菌C48-1，使OD600 nm值在0.5左右，將菌液均勻涂布于MHA平板上，待干燥后將中藥藥敏紙片均勻分布于瓊脂表面，每個(gè)平板3次重復(fù)，37 ℃培養(yǎng)24 h后用直尺測(cè)量抑菌圈直徑。

1.5? 單味中藥提取物最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定

取菌液50 μL分別加入含有不同濃度中藥的肉湯培養(yǎng)基中，肉湯培養(yǎng)基中中藥的濃度自第1孔開始依次倍比釋釋至第11孔，第12孔不加中藥提取液，作為空白對(duì)照。每孔肉湯培養(yǎng)基和藥液各50 μL，

37 ℃培養(yǎng)24 h后取出，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，與濁度對(duì)照組比較，以肉眼觀察無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度判定為中藥的最小抑菌濃度MIC值。將上述中藥組中的細(xì)菌被完全抑制的管中液體取100 μL接種涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基平板上，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。以肉眼觀察菌落不生長(zhǎng)視為100%被殺滅，此最低藥物濃度值為其最小殺菌濃度MBC值。

1.6? 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

劃線接種禽多殺性巴氏桿菌C48-1，挑單菌落接種于10 mL新鮮TSB培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min搖床過(guò)夜培養(yǎng)，按1%的接種量接種于TSB培養(yǎng)基，添加厚樸酚藥液使厚樸酚終濃度分別為0、2、4、6、8 μg/mL，每隔1 h測(cè)定一次OD600 nm值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.7? 厚樸酚體內(nèi)抑菌試驗(yàn)

購(gòu)置60只50～60日齡江漢雞，分為4組;第一組、第二組和第三組給藥劑量按每千克體重2.5 mg拌服料喂，分別為143 mg/（只·d）、286 mg/（只·d）和429 mg/（只·d）;第四組為對(duì)照組（不添加任何藥物）。再?gòu)?80 ℃冰箱復(fù)蘇禽多殺性巴氏桿菌C48-1菌株，10倍稀釋8個(gè)梯度，攻毒經(jīng)飼喂7 d的江漢土雞，并將攻毒菌液涂布TSA進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，觀察雞只健康情況，記錄試驗(yàn)結(jié)果。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 單味中藥提取物抑菌圈直徑大小

5種中草藥提取物對(duì)禽多殺性巴氏桿菌C48-1的抑菌圈大小見(jiàn)表1。從表1可以看出，厚樸酚、黃藤素和秦皮對(duì)禽多殺性巴氏桿菌C48-1均有一定的抑菌作用，其中厚樸酚的抑菌效果最佳;大黃素和黃柏提取物對(duì)禽多殺性巴氏桿菌C48-1沒(méi)有抑菌效果。

2.2? 單味中藥提取物最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC）

厚樸酚、黃藤素和秦皮的MIC、MBC結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，厚樸酚對(duì)禽多殺性巴氏桿菌C48-1的MIC為8 μg/mL，MBC為16 μg/mL;黃藤素的MIC為256 μg/mL，MBC為512 μg/mL;秦皮的MIC為64 μg/mL，MBC為256 μg/mL;因此，后續(xù)選擇抑菌和殺菌效果最好的厚樸酚進(jìn)行體內(nèi)抑菌試驗(yàn)。

2.3? 厚樸酚對(duì)禽多殺性巴氏桿菌增殖的影響

由圖1可以看出，加入厚樸酚為6 μg/mL時(shí)，細(xì)菌的生長(zhǎng)速度相比對(duì)照組受到明顯抑制，在第2～8小時(shí)恢復(fù)生長(zhǎng)，但總體比對(duì)照組慢很多。最終OD600 nm最大值均接近1.5，說(shuō)明厚樸酚能減緩禽多殺性巴氏桿菌C48-1的生長(zhǎng)，但不影響生長(zhǎng)極限。當(dāng)藥物濃度為MIC值（8 μg/mL）時(shí)，OD值為一條水平直線，禽多殺性巴氏桿菌C48-1生長(zhǎng)被完全抑制。

2.4? 厚樸酚對(duì)禽多殺性巴氏桿菌C48-1的體內(nèi)抑菌結(jié)果

由平板計(jì)數(shù)結(jié)果得知，禽多殺性巴氏桿菌C48-1對(duì)江漢雞的攻毒量為50 CFU。由表3可知，添加厚樸酚的試驗(yàn)組存活率高于對(duì)照組，且隨著中藥劑量的增加，保護(hù)率由第一組的10%提高到第二組的50%，繼續(xù)增加厚樸酚劑量，保護(hù)率穩(wěn)定在50%不再增加，說(shuō)明厚樸酚對(duì)江漢雞體內(nèi)感染禽多殺性巴氏桿菌C48-1有一定的保護(hù)作用，但不能達(dá)到完全抑菌。

3? 小結(jié)與討論

禽霍亂是由禽多殺性巴氏桿菌引起的接觸性敗血性傳染病，感染后發(fā)病率快，死亡迅速，死亡率高。中藥作為抗生素的良好替代物，在禽病防治中逐漸得到應(yīng)用[6]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，厚樸酚、黃藤素對(duì)革蘭陰性菌禽多殺性巴氏桿菌C48-1有抑菌活性，其中厚樸酚抑菌效果較強(qiáng)。這與牛國(guó)一等[7]報(bào)道的結(jié)果一致。李輝明[8]研究表明了牛致病性巴氏桿菌對(duì)秦皮和蒲公英兩種藥物低度敏感，這與本試驗(yàn)中秦皮對(duì)禽多殺性巴氏桿菌有中度抑菌效果基本一致。

中藥的不同提取部位抑菌活性不同，大多數(shù)中藥的有效提取物對(duì)細(xì)菌、病毒等都有一定的抑制作用。張海暉等[9]報(bào)道了大黃提取物大黃素對(duì)禽巴氏桿菌的抑菌圈為12.02 mm，MIC為28.13 μg/mL。曲徑等[10]研究發(fā)現(xiàn)，黃柏、艾葉、黃連、地榆有效部位提取物對(duì)巴氏桿菌的MIC為7.8 mg/mL。常超越等[11]發(fā)現(xiàn)雞源多殺性巴氏桿菌對(duì)黃柏高度敏感。這與本試驗(yàn)的結(jié)果存在差異，可能是由于中藥提取方法和工藝不同，得到的有效成分和純度不同，從而導(dǎo)致抑菌結(jié)果存在差異。

厚樸酚對(duì)禽多殺性巴氏桿菌的生長(zhǎng)曲線顯示，當(dāng)厚樸酚濃度≤1/2 MIC時(shí)，禽多殺性巴氏桿菌活性部分被抑制，添加厚樸酚試驗(yàn)組比對(duì)照組進(jìn)入對(duì)數(shù)期時(shí)間推遲，但厚樸酚不影響細(xì)菌的生長(zhǎng)極限;當(dāng)厚樸酚濃度在1/2 MIC～MIC時(shí)，禽多殺性巴氏桿菌活性明顯被抑制;謝麗玲等[12]研究黃芩醇對(duì)副溶血性弧菌的抑制機(jī)制時(shí)，也發(fā)現(xiàn)了添加中藥后細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)期時(shí)間被延長(zhǎng)。厚樸酚體內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，江漢雞在連續(xù)添加不同劑量厚樸酚的飼料飼喂7 d后，用禽多殺性巴氏桿菌C48-1攻毒，飼喂劑量從143 mg/（只·d）增加到286 mg/（只·d），保護(hù)率從10%增長(zhǎng)到50%，進(jìn)一步增加中藥劑量，保護(hù)率不再上升，可能與雞只對(duì)中藥的吸收和代謝相關(guān)。

目前，中藥替代抗生素進(jìn)行禽病防控的需求越來(lái)越大，中藥富含多種活性的化學(xué)抗菌物質(zhì)，但是中藥的抗菌機(jī)理尚未研究明確，有待進(jìn)一步研究。本研究為進(jìn)一步研發(fā)中藥制劑預(yù)防禽多殺性巴氏桿菌病提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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