姚秀英 劉南南 王桂清

摘要：菌核生枝頂孢霉（Acremonium sclerotigenum）作為枝頂孢屬真菌的優(yōu)勢(shì)種，其次生代謝產(chǎn)物多樣。為了明確其對(duì)植物病害致病菌的抑制效果，以桃褐斑致病菌（Alternaria alternata）為靶標(biāo)菌，采用菌絲生長(zhǎng)速率法和孢子萌發(fā)法測(cè)定6種發(fā)酵液的抑菌活性。結(jié)果表明：PD培養(yǎng)基發(fā)酵液提取物對(duì)桃褐斑致病菌的抑制效果最好，對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的EC50分別為53.673 4 mg/L和808.158 4 mg/L;培養(yǎng)5 d的PD培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑菌效果最好，對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的EC50分別為1.445 8 mg/L和309.631 8 mg/L;菌核生枝頂孢霉發(fā)酵液對(duì)桃褐斑致病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果優(yōu)于對(duì)孢子萌發(fā)效果。該研究結(jié)果為將其開(kāi)發(fā)成生物源農(nóng)藥奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：菌核生枝頂孢霉;內(nèi)生菌;次生代謝物，培養(yǎng)條件;抑菌活性

中圖分類(lèi)號(hào)：Q93 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ?文章編號(hào)：1674-1161（2019）03-0018-05

隨著人們對(duì)無(wú)污染、無(wú)公害綠色食品呼聲日益提高，生物防治成為繼農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治之后的又一種重要防治方法，許多生物殺菌劑相繼問(wèn)世，并廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)，取得了顯著效果。植物內(nèi)生菌是微生物中非常重要的類(lèi)群，其可以分泌抗生素、毒素等代謝物質(zhì)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性（ISR），將其次生代謝物制成藥劑可起到生物防治作用，從而減少對(duì)生態(tài)環(huán)境的污染。植物內(nèi)生菌為抗（抑）菌活性成分的篩選開(kāi)辟了新的來(lái)源，在農(nóng)業(yè)上具有非常廣闊的應(yīng)用前景。枝頂孢屬真菌（Acremonium sp.）是一種世界性分布的絲狀真菌，約有130余種，主要為腐生、植物寄生和自生，具有豐富的遺傳和生態(tài)多樣性，其次生代謝物多樣（包括萜類(lèi)、酚類(lèi)、環(huán)肽、蒽醌類(lèi)、生物堿類(lèi)等），生物活性良好，是一類(lèi)能夠抑制多種植物病原真菌生長(zhǎng)的拮抗真菌。本課題從國(guó)槐枝干中分離到一種枝頂孢屬真菌，經(jīng)形態(tài)、分子和致病性鑒定，最終確定為菌核生枝頂孢霉（A. sclerotigenum）。為了明確該內(nèi)生菌的抑菌效果，以桃褐斑致病菌（Alternaria alternata）為靶標(biāo)菌，采用菌絲生長(zhǎng)速率法和孢子萌發(fā)法測(cè)定6種發(fā)酵液提取物的抑制活性，篩選出誘導(dǎo)菌核生枝頂孢霉有效次生代謝物產(chǎn)生的最適培養(yǎng)基和最適培養(yǎng)天數(shù)，為將其開(kāi)發(fā)成生物源農(nóng)藥奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種活化與培養(yǎng)

目標(biāo)菌為菌核生枝頂孢霉，靶標(biāo)菌為桃褐斑致病菌，均由聊城大學(xué)植物病理研究室提供，在PDA培養(yǎng)基、25±1 ℃條件下恒溫培養(yǎng)5～10 d備用。

1.2 發(fā)酵液制備與提取

供試液體培養(yǎng)基包括：1） Fries培養(yǎng)基。蔗糖30.0 g，酒石酸銨5.0 g，KH2PO4 1.0 g，NH4NO3 1.0 g，MgSO4 0.5 g，NaCl 0.1 g，結(jié)晶CaCl2 0.1 g，酵母膏1.0 g，蒸餾水1 000 mL。2） Czapek培養(yǎng)基。NaNO3 3.0 g，K2HPO4 1.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4 0.01 g，蔗糖30.0 g，蒸餾水1 000 mL。3） 基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基。牛肉膏1.8 g，蛋白胨6.0 g，蒸餾水600 mL，磷酸氫二鉀0.6 g。4） 改良沙氏培養(yǎng)基。葡萄糖12.0 g，蛋白胨6.0 g，蒸餾水600 mL。5） 酵母麥芽汁葡萄糖培養(yǎng)基（YMG）。葡萄糖4.0 g，麥芽提取物10.0 g，酵母提取物4.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.5±0.2。6） PD培養(yǎng)基。馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，蒸餾水1 000 mL。

在裝有300 mL不同液體培養(yǎng)基的錐形瓶（經(jīng)高壓滅菌）中接入直徑為0.7 cm的菌核生枝頂孢霉菌片，每瓶45個(gè)。于25±1 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)7 d，經(jīng)真空抽濾得到的濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（溫度60 ℃）濃縮，直至冷凝管中無(wú)溶液滴下，得到次生代謝物粗提物。對(duì)PD培養(yǎng)基進(jìn)行3，5，7，9，11 d培養(yǎng)篩選，方法如上。

粗提物用三重水溶解，配制成20 000，10 000，

5 000，2 500，1 250 mg/L的濃度梯度，用于抑菌活性測(cè)定。

1.3 抑菌活性測(cè)定方法

1.3.1 生長(zhǎng)速率法 采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定不同培養(yǎng)基發(fā)酵液提取物對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制效果。將備用各濃度提取液與PDA培養(yǎng)基以1∶9的比例制成系列含藥培養(yǎng)基，使之終濃度為2 000，1 000，500，250，125 mg/L;接入直徑0.7 cm的靶標(biāo)菌菌餅，以加入等量無(wú)菌水的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，3次重復(fù)，于25±1 ℃，L∶D=

12∶12條件下恒溫培養(yǎng)5 d，計(jì)算抑制率。

1.3.2 孢子萌發(fā)法 采用孢子萌發(fā)法測(cè)定發(fā)酵液提取物對(duì)孢子萌發(fā)的抑制效果。將備用各濃度提取液與靶標(biāo)菌孢子懸浮液按體積比1∶5混合，使之終濃度為

3 333.3，1 666.7，833.3，416.7，208.3 mg/L;凹載玻片中加入混合液10 μL，于25±1 ℃下黑暗保濕培養(yǎng)24 h，3次重復(fù)，顯微鏡下觀察孢子數(shù)及孢子萌發(fā)狀況（至少觀察100個(gè)孢子），計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)整理，經(jīng)DPSv7.05統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析、差異顯著性檢驗(yàn)、相關(guān)系數(shù)、線性回歸等。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基發(fā)酵液對(duì)桃褐斑致病菌的抑制作用

2.1.1 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制效果 培養(yǎng)7 d的6種培養(yǎng)基發(fā)酵液提取物對(duì)桃褐斑致病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果如圖1和表1所示。

由圖1和表1可以看出：不同培養(yǎng)基發(fā)酵液對(duì)桃褐斑致病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果不同，且抑制效果均隨著發(fā)酵液濃度提高呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，即抑制率與濃度呈線性正相關(guān)。其中，PD培養(yǎng)基發(fā)酵液對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制效果最好，各濃度的抑菌效果均在55%以上，EC50為53.673 4 mg/L;Fries培養(yǎng)基、Czapek培養(yǎng)基、基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基、改良沙氏培養(yǎng)基、YMG培養(yǎng)基這5種培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑菌效果一般，抑制率均在26%以下，EC50均超過(guò)30 000.000 0 mg/L。

2.1.2 對(duì)孢子萌發(fā)的抑制效果 6種培養(yǎng)基發(fā)酵液提取物對(duì)桃褐斑致病菌孢子萌發(fā)的抑制效果如圖2和表2所示。

由圖2和表2可以看出：不同培養(yǎng)基發(fā)酵液提取物對(duì)桃褐斑致病菌孢子萌發(fā)的抑制效果趨勢(shì)與對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制效果趨勢(shì)相同。雖然PD培養(yǎng)基發(fā)酵液提取物對(duì)孢子萌發(fā)的抑制效果最好，但不及對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制效果，各濃度的抑制率均在25%以上，EC50為808.158 4 mg/L，是菌絲生長(zhǎng)EC50的15.06倍，說(shuō)明其對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制效果是孢子萌發(fā)的15.06倍;其他5種培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑制率均在30%以下，EC50在30 000.000 0 mg/L～170 000.000 0 mg/L之間，抑制效果較差。

綜合對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制效果，說(shuō)明PD培養(yǎng)基是誘導(dǎo)菌核生枝頂孢霉產(chǎn)生抑制桃褐斑致病菌效果最好的次生代謝物的最適培養(yǎng)基。

2.2 PD培養(yǎng)基不同培養(yǎng)時(shí)間發(fā)酵液提取物對(duì)桃褐斑致病菌的抑制作用

2.2.1 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制效果 分別培養(yǎng)3，5，7，9，11 d的PD培養(yǎng)基發(fā)酵液提取物對(duì)桃褐斑病菌菌絲的抑制效果如圖3和表3所示。

由圖3和表3可以看出：不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液對(duì)桃褐斑致病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果不同，且抑制效果均隨著發(fā)酵液濃度提高而增長(zhǎng)，即抑制率與濃度呈線性正相關(guān)。其中，培養(yǎng)5 d的發(fā)酵液對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好，各濃度的抑制效果均在83%以上，EC50為1.445 8 mg/L;3，7，9，11 d的抑制效果均不及5 d的抑制效果，EC50均超過(guò)6.000 0 mg/L。

2.2.2 對(duì)孢子萌發(fā)的抑制效果 不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液提取物對(duì)桃褐斑致病菌孢子萌發(fā)的抑制效果如圖4和表4所示。

由圖4和表4可以看出：除208.3 mg/L和416.7 mg/L處略低于11 d外，培養(yǎng)5 d的發(fā)酵液對(duì)桃褐斑致病菌孢子萌發(fā)的抑制效果總體高于其他4個(gè)時(shí)間。雖然5 d的發(fā)酵液提取物抑制效果最好，但不及對(duì)菌絲生長(zhǎng)的效果，各濃度的抑制率均在30%以上，EC50為309.631 8 mg/L，為菌絲生長(zhǎng)EC50的214.16倍，說(shuō)明其對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制效果是孢子萌發(fā)的214.16倍;其他4個(gè)時(shí)間發(fā)酵液的EC50在315.000 0～

1 500.000 0 mg/L之間，抑制效果較差。

3 結(jié)論與討論

為了明確菌核生枝頂孢霉（Acremonium sclerotigenum）對(duì)植物病害致病菌的抑制效果，采用菌絲生長(zhǎng)速率法和孢子萌發(fā)法測(cè)定其6種培養(yǎng)基發(fā)酵液對(duì)桃褐斑致病菌的抑菌活性，并進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)間篩選。結(jié)果表明：PD培養(yǎng)基發(fā)酵液提取物活性最強(qiáng)，培養(yǎng)5 d的抑菌效果最好。

從營(yíng)養(yǎng)角度分析，培養(yǎng)基中普遍含有水分、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)和生長(zhǎng)素，營(yíng)養(yǎng)條件合適與否直接影響真菌的產(chǎn)毒及產(chǎn)生毒素的量，即影響真菌代謝產(chǎn)物的抑菌效果。PD培養(yǎng)基中的馬鈴薯浸出液含有碳源、氮源、生長(zhǎng)物質(zhì)、礦物質(zhì)等多種微生物生長(zhǎng)所需物質(zhì)，有助于各種霉菌生長(zhǎng)，而Fries缺少氮源、Czapek缺少氮源和生長(zhǎng)物質(zhì)、改良沙氏缺少礦物質(zhì)、YMG缺少氮源和礦物質(zhì)、基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基缺少碳源物質(zhì)，與PD培養(yǎng)基相比營(yíng)養(yǎng)不全面。

枝頂孢屬不同菌種在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的發(fā)酵物對(duì)不同病原菌的抑菌活性不同。姚磊等人利用瓊脂平板擴(kuò)散法測(cè)定枝頂孢屬真菌SC0105在小麥與YMG混合培養(yǎng)基中發(fā)酵不同天數(shù)的發(fā)酵物對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌活性，結(jié)果表明，SC0105在小麥與YMG混合培養(yǎng)基中發(fā)酵16 d的發(fā)酵物抑菌活性最強(qiáng)。而本課題研究表明，菌核生枝頂孢霉（Acremonium sclerotigenum）在PD培養(yǎng)基中發(fā)酵5 d的發(fā)酵物對(duì)桃褐斑致病菌（Alternaria alternata）的抑菌活性最強(qiáng)。

對(duì)植物內(nèi)生真菌的生物防治已有大量研究，結(jié)果表明，從植物內(nèi)生真菌中可發(fā)現(xiàn)新穎且具有抗菌活性的次生代謝產(chǎn)物，其中某些化合物的活性較強(qiáng)，具有開(kāi)發(fā)成為新一類(lèi)抗菌藥物的潛力。菌核生枝頂孢霉作為一種內(nèi)生菌，其次生代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究尚少，本課題篩選誘導(dǎo)其對(duì)桃褐斑致病菌產(chǎn)生生物活性物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基和誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)，明確培養(yǎng)5 d的PD培養(yǎng)基為最適發(fā)酵條件，為將其開(kāi)發(fā)成生物源農(nóng)藥奠定了理論基礎(chǔ)。關(guān)于菌核生枝頂孢霉的殺菌抑菌譜和作用機(jī)理等均有待于進(jìn)一步探索。

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