金美玲,邱 強(qiáng),徐 晨,李 新,張 敏,張偉光,李典耕,趙素梅*

(1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院腎內(nèi)科,北京 100020;2 解放軍總醫(yī)院腎科;*通訊作者,E-mail:zhaosumei1998@126.com)

IgA腎病是全球特別是中國最常見的腎小球疾病,約占原發(fā)性腎小球疾病的45%,20% -40%的IgA腎病患者確診后10-20年進(jìn)展至終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)[1]。目前認(rèn)為IgA腎病病因是免疫復(fù)合物介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng),由IgA1免疫復(fù)合物在腎小球系膜沉積引起的,主要表現(xiàn)為腎小球系膜細(xì)胞增殖及系膜基質(zhì)積聚[2]。雖然在基礎(chǔ)/臨床研究方面,IgA腎病取得一定的研究進(jìn)展,但對于IgA腎病的具體發(fā)病機(jī)制尚不能明確。近年來,基于高通量測序平臺的基因表達(dá)分析在研究疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)機(jī)制及分子診斷方面發(fā)揮了重要作用,且得益于公共數(shù)據(jù)庫的建立,多種人類疾病的芯片檢測結(jié)果可以在公共數(shù)據(jù)庫中檢索到,基于這些公開的芯片檢測結(jié)果,由于數(shù)據(jù)注釋結(jié)果的不斷更新,不僅可以對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行重新分析得到新的分析結(jié)果,也可以將多個(gè)芯片結(jié)果進(jìn)行整合分析得到更為全面的分析結(jié)果,此類研究屬于生物信息學(xué)范疇,生物信息學(xué)是將生命科學(xué)與計(jì)算機(jī)科學(xué)相結(jié)合的科學(xué),利用計(jì)算機(jī)信息技術(shù)挖掘與生物過程相關(guān)的基因/通路,近幾年此類研究發(fā)表較多[3]。在本研究中,我們對基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,GEO)公共數(shù)據(jù)庫中IgA腎病患者及正常對照者的血液和腎小球組織的芯片檢測結(jié)果進(jìn)行重新注釋分析,旨在研究參與IgA腎病發(fā)生的關(guān)鍵通路/基因,以期深入了解IgA腎病發(fā)生機(jī)制、篩選用于診斷/預(yù)后評估IgA腎病的分子診斷標(biāo)志物。

1 方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從GEO公共數(shù)據(jù)庫中下載GSE73953和GSE93798芯片檢測結(jié)果,GSE73953為IgA腎病患者(15例)和正常對照者(2例)的外周血白細(xì)胞基因表達(dá)譜,GSE93798為IgA腎病患者(20例)和正常對照者(22例)的腎小球腎組織基因表達(dá)譜。

1.2 篩選差異表達(dá)基因

應(yīng)用Morpheus(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)在線分析工具對上述兩個(gè)芯片結(jié)果進(jìn)行分析,對IgA腎病組和正常對照組的各個(gè)基因表達(dá)值通過t檢驗(yàn)篩選P<0.01、高表達(dá)/低表達(dá)的1 000個(gè)基因,然后取交集。

1.3 差異表達(dá)基因的富集分析

基因本體(gene ontology,GO)分析是對基因及基因產(chǎn)物進(jìn)行注釋,識別生物學(xué)特性[4]。京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析是將基因組信息與高階功能信息聯(lián)系起來,系統(tǒng)分析基因功能[5]。DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)是進(jìn)行基因富集分析的常用數(shù)據(jù)庫,我們應(yīng)用DAVID在線工具對篩選的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG分析[6],P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 蛋白互作分析

檢索相互作用基因的搜索工具(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,STRING)數(shù)據(jù)庫用來分析蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI),我們將差異表達(dá)基因輸入到STRING在線工具中,篩選combined score>0.4的互作蛋白。然后將得到的PPI結(jié)果輸入到Cytoscape軟件中,通過分子復(fù)合物檢測(molecular complex detection,MCODE)分析模板篩選關(guān)鍵基因,即MCODE scores>3,數(shù)量>4,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選差異表達(dá)基因

應(yīng)用Morpheus分別對GSE73953和GSE93798數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,取1 000個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因和1 000個(gè)下調(diào)差異表達(dá)基因,兩組差異表達(dá)基因取交集,結(jié)果示外周血共篩選出1 804個(gè)差異基因、腎小球組織篩選中2 000個(gè)基因,其中184個(gè)基因?yàn)楣灿械牟町惐磉_(dá)基因(見圖1),以下將對這184個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。

圖1 IgA腎病患者外周血及腎小球組織差異表達(dá)基因情況Figure 1 Differentially expressed genes associated with IgA nephropathy in PBMCs and glomerular tissues

2.2 GO富集分析和KEGG分析

應(yīng)用DAVID在線工具對這184個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG分析,GO分析結(jié)果(見表1)提示:①生物過程:差異表達(dá)基因顯著富集于細(xì)胞外基質(zhì)形成、細(xì)胞外結(jié)構(gòu)形成、凋亡過程調(diào)節(jié)、程序性死亡調(diào)節(jié)、細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)等;②細(xì)胞組成:差異表達(dá)基因顯著富集于細(xì)胞外區(qū)域部分、胞外區(qū)、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外隙、細(xì)胞外基質(zhì)成分等;③分子功能:差異表達(dá)基因顯著富集于分子功能調(diào)節(jié)、酶調(diào)節(jié)活性、大分子復(fù)合物結(jié)合、蛋白激酶調(diào)節(jié)活性、激酶調(diào)節(jié)活性等。KEGG分析結(jié)果提示差異表達(dá)基因顯著富集于局部黏附、Fc-r介導(dǎo)的吞噬作用、ECM-受體相互作用、MAPK信號通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移等通路(見表2)。

表1 IgA腎病相關(guān)184個(gè)差異表達(dá)基因的GO分析和KEGG分析結(jié)果Table 1 Gene ontology analysis and KEGG analysis of differentially expressed genes associated with IgA nephropathy

GO:基因本體分析;BP:biological process生物過程;CC:cellular component細(xì)胞組成;MF:molecular function分子功能;KEGG:京都基因與基因組百科全書分析;P為t檢驗(yàn)P值

表2 IgA腎病相關(guān)關(guān)鍵基因群的KEGG分析Table 2 KEGG analysis of key differentially expressed genes associated with IgA nephropathy

2.3 蛋白互作分析篩選關(guān)鍵基因

通過STRING數(shù)據(jù)庫對184個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白互作分析(見圖2),結(jié)果提示中樞節(jié)點(diǎn)最高(即關(guān)鍵基因)為PTPRC、FN1、PECAM1、AGTR1、POSTN、AGT、COL4A1、TP53、CYR61、MGAM。使用Cytoscape的MCODE模塊對STRING的蛋白互作結(jié)果進(jìn)行分析篩選關(guān)鍵基因群,最顯著的基因群見圖3,富集分析提示這個(gè)基因群主要富集于腎素-血管緊張素系統(tǒng)等通路。

3 討論

IgA是我國最常見的原發(fā)性腎小球腎炎類型,是導(dǎo)致CKD、ESRD的重要病因,深入研究IgA腎病的分子機(jī)制對于IgA腎病的診斷和治療具有重要意義。近幾年隨著芯片技術(shù)和高通量測序的不斷發(fā)展,可以同時(shí)獲得人類基因組中數(shù)千個(gè)基因的表達(dá)水平,結(jié)果將有益于篩選疾病的診斷標(biāo)志物及靶向治療分子。目前認(rèn)為IgA腎病是多種途徑參與的自身免疫炎癥相關(guān)性疾病,在IgA腎病患者腎臟免疫病理發(fā)現(xiàn)有免疫球蛋白和補(bǔ)體在腎小球系膜沉積[7,8],在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物模型可由慢性血清病引起,說明循環(huán)免疫合物在腎小球沉積可能是病因之一[9],另外抗Thy1腎炎大鼠模型中,抗體直接與系膜細(xì)胞膜上的固有抗原反應(yīng)形成免疫復(fù)合物而致病[10],綜上IgA腎病是機(jī)體異常的免疫炎癥反應(yīng)引起的免疫復(fù)合物在腎臟腎小球基底膜沉積誘導(dǎo)系膜活化、增殖引起IgA腎病發(fā)生。

圖2 184個(gè)差異表達(dá)基因蛋白互作結(jié)果Figure 2 Protein-protein interaction of 184 differentially expressed genes

圖3 IgA腎病相關(guān)關(guān)鍵差異表達(dá)基因蛋白互作結(jié)果Figure 3 Protein-protein interaction of key genes associated with IgA nephropathy

本研究的亮點(diǎn)在于利用疾病公共數(shù)據(jù)芯片結(jié)果,整合不同研究的芯片結(jié)果,對比分析IgA腎病患者和正常對照者的血清和腎臟組織基因表達(dá),篩選出的公共差異基因可能是參與IgA腎病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因,可為后續(xù)機(jī)制研究提供方向,對這類目標(biāo)基因進(jìn)行研究不僅可以從機(jī)體整體角度深入了解IgA腎病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,也可成為IgA腎病血清分子診斷標(biāo)志物。

基于以上基礎(chǔ),我們在GEO公共數(shù)據(jù)庫中檢測關(guān)于IgA腎病相關(guān)芯片結(jié)果,篩選出GSE73953(IgA腎病患者和正常對照者外周血細(xì)胞基因表達(dá)譜)和GSE93798(IgA腎病患者和正常對照者腎小球基因表達(dá)譜)芯片結(jié)果作為研究對象,首先應(yīng)用Morpheus分析得到外周血細(xì)胞和腎小球的差異表達(dá)基因,通過取交集得到184個(gè)外周血細(xì)胞和腎小球共有的差異表達(dá)基因,這184個(gè)差異表達(dá)基因可以認(rèn)為是可能參與IgA腎病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因,通過對184個(gè)差異表達(dá)基因的富集分析,我們可以了解184個(gè)差異表達(dá)基因參與IgA腎病的途徑/通路,GO分析中生物過程和細(xì)胞組成富集分析結(jié)果提示184個(gè)差異表達(dá)基因可能通過影響細(xì)胞外基質(zhì)/結(jié)構(gòu)及細(xì)胞凋亡/死亡發(fā)揮作用,KEGG通路分析結(jié)果提示184個(gè)差異表達(dá)基因顯著富集于局部黏附、Fc-r介導(dǎo)的吞噬作用、ECM-受體相互作用、MAPK信號通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移等通路。既往研究發(fā)現(xiàn)局部黏附途徑參與炎癥、纖維化、遷移、有絲分裂等過程,結(jié)締組織生長因子可以通過溶解局部黏附復(fù)合物激活細(xì)胞極化進(jìn)行刺激系膜細(xì)胞遷移[11],免疫復(fù)合物通過Fc-受體Ⅰ和Ⅲ刺激系膜細(xì)胞產(chǎn)生Ⅳ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)[12],系膜細(xì)胞ECM異常是IgA腎病發(fā)生發(fā)展的重要因素,對于促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)及炎癥浸潤發(fā)揮重要作用[13]。MAPK是參與IgA腎病發(fā)生發(fā)展的經(jīng)典通路,PDGF-BB、TGF-β、Ang-Ⅱ、IgA等是經(jīng)典的系膜細(xì)胞活化因子,PDGF-BB通過MAPK通路誘導(dǎo)系膜活化,IgA1免疫復(fù)合物介導(dǎo)激活MAPK/ERK通路,促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖,引起IgA腎病腎小球損傷,新近發(fā)現(xiàn)的刺激因子也大多通過MAPK通路誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖[14,15],因此MAPK通路在系膜細(xì)胞活化/增殖過程中起重要作用,白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移途徑對于誘導(dǎo)炎細(xì)胞浸潤及促進(jìn)炎癥發(fā)生發(fā)展具有重要作用?？偨Y(jié)差異表達(dá)基因的富集分析結(jié)果,我們猜測某種因素誘導(dǎo)機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)可能通過影響腎小球系膜細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)/結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡/死亡、細(xì)胞黏附,介導(dǎo)炎細(xì)胞浸潤,通過MAPK等通路參與IgA腎病發(fā)生發(fā)展過程。我們又進(jìn)一步對184個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行蛋白互作分析,篩選IgA相關(guān)的關(guān)鍵基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)前10個(gè)關(guān)鍵基因?yàn)镻TPRC、FN1、PECAM1、AGTR1、POSTN、AGT、COL4A1、TP53、CYR61、MGAM。這些基因與IgA腎病關(guān)系的研究較少，可能為IgA腎病發(fā)生新的基因，這不僅為我們深入研究IgA腎病的發(fā)生機(jī)制提供方向,也可能成為IgA腎病潛在分子診斷標(biāo)志物。同時(shí),我們使用Cytoscape的MCODE模塊對STRING的蛋白互作結(jié)果進(jìn)行分析篩選關(guān)鍵基因群,篩選出最顯著的基因群(包括24個(gè)基因),這些基因顯著富集于腎素-血管緊張素等通路,結(jié)果也間接證明ACEI/ARB類藥物對于IgA腎病的治療是有益處的。

綜上所述,通過對IgA腎病基因芯片進(jìn)行重新注釋、整合分析,有助于深入研究IgA腎病的發(fā)生發(fā)展作用機(jī)制,篩選的關(guān)鍵基因可能成為干預(yù)IgA腎病的靶點(diǎn),并可成為評估IgA腎病診斷和預(yù)后的潛在分子診斷標(biāo)志物。